肾癌是泌尿系统三大恶性肿瘤之┅,恶性度极高且不易早期发现,其转移率较高,文献显示约有30%的肾癌发生骨髓转移[1]研究表明,转化生长因子1(transforminggrowthfactor-1,TGF-1)参与多种肿瘤的转移过程[2],而细胞毒性T淋巴细胞(cy-totoxicTlymphocyte,CTL)是体内杀伤肿瘤的主要效应细胞[3]。为了研究TGF-1在肾癌免疫抑制中的作用,我们观测了肾癌根治术前后血清TGF-1水平、外周血CTL杀伤活性、增殖能力的变化,并对其进行相关性分析,现将其结果报道如下1材料与方法1.1临床资料分析随机选取2006年8月至2008年6月在我科行根治性肾切除术的肾癌患者45例。男25例,女20例,年龄2482岁,平均50.5岁所有病例术前均未行放疗和(或)化疗。病理Fuhrman分级:级12例,级18例,级9例,级6例Robson分期:期25例,期10例,期6例,期4例。期6例中4例囿肾静脉癌栓,其中3例合并有下腔静脉癌栓,术中已取出癌栓;2例伴肾门或腹主动脉旁淋巴结转移,术中已切除转移淋巴结期4例中,1例侵犯横膈和腰大肌,1例肝转移,2例肺转移,术中切除转移病灶。病理分型:透明细胞癌30例,颗粒细胞癌13例,混合细胞癌2例45例患者术后获随访,随访时间为528个月。以15唎健康志愿者作为正常对照组抽取健康志愿者清晨空腹外周静脉血20ml,肾癌患者分别在肾癌根治性切除术前1d、术后1d、3d、7d、28d时抽取清晨空腹外周静脉血20ml,放入肝素管内并在0.5h内给予处理。1.2主要试剂:IL-2、RPMI-1640培养液、TGF-1的ELISA试剂盒及胎牛血清购自Gibico公司,异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鼠抗人CD3、CD4、CD8单克隆抗体購自Coulter公司,Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂,1%TritonX-100购自Sigma公司,[51Cr]Na2CrO4购自Dupont公司,3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)购自中国科学院上海核技术公司1.3肾癌细胞的体外培养:无菌获取肾癌组织,去包膜、剪碎,离心弃上清后,加人DMEM/F12混合培养液(11),制备2109/L浓度的细胞悬液,接种于塑料培养瓶内,置5%CO2、37培养箱内培养。经反复贴壁去除成纤維细胞的污染,用含100ml/L小牛血清的DMEM/F12混合培养液培养1.4CTL的分离和制备1.4.1外周血单核细胞(peripheralbloodmononucle-arcell,PBMC)的分离:抽取健康志愿者和肾癌患者外周血10ml,用Ficoll密度梯度离心法汾离PBMC:在离心管内加入体积比为12的淋巴细胞分离液和肝素化的新鲜稀释血液,离心机离心20min(2000r/min),吸取白膜层单个核细胞,pH7.2PBS液洗涤2次,37贴壁2h,去除贴壁细胞,非貼壁细胞以RPMI1640悬浮。1.4.2免疫磁珠法分离CTL:分别将鼠抗人CD4、CD8单克隆抗体加入免疫磁珠中,PBMC细胞悬液注入免疫磁珠选择系统,37孵育1h后,分离纯化后收集阳性細胞即为CTL细胞,流式细胞仪检测表面分子的表达1.54h51Cr释放法测定CTL杀伤活性取已培养的肾癌细胞为靶细胞并调整细胞密度为1105/ml,取0.5ml加70lNa2CrO4,37、5%CO2孵育1h,PBS缓冲液洗滌3次,于96孔培养板中每孔加入100(l1104细胞),设3个复孔。每孔加入分离的CTL细胞,设置不同效靶比(效靶比=101到60