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microRNA鉴定与功能分析技术
《microRNA鉴定与功能分析技术》是2012年化学工业出版社出版的图书。
microRNA鉴定与功能分析技术图书信息
丛书名: 生物实验室系列
正文语种: 简体中文
商品尺寸: 23.8 x 16.8 x 1.6 cm
商品重量: 422 g
microRNA鉴定与功能分析技术内容简介
《microRNA鉴定与功能分析技术》综合国内外有关microRNA研究的进展，首先介绍了microRNA的发现历程、生物起源及加工成熟的机制、特征及鉴别等，然后在阐述microRNA作用机制的基础上，详细介绍了microRNA的调控机理及其在生理、病理进程中的功能，并着重探讨了几种主要非编码RNA的区别。随后，重点介绍microRNA的研究方法，涉及生物信息学分析方法与分子生物学方法，前者包括microRNA相关的数据库及序列信息获取、microRNA基因簇的分析策略、种系发育分析策略以及microRNA的转录调控等；后者则包括新microRNA基因的探索与克隆、microRNA的表达分析方法、microRNA表达干预方法以及功能研究策略等。最后编者根据自己的工作实践，系统介绍了microRNA相关研究方法在肝细胞癌研究中的应用。《microRNA鉴定与功能分析技术》具有理论结合实际、系统性强等特点，由子取材新颖、图文并茂，对从事microRNA研究同行具有较高的参考价值，适合从事生命科学研究的科研人员及高等院校师生阅读。
microRNA鉴定与功能分析技术目录
第一章 概述
第一节 microRNA的发现历程
第二节 microRNA的起源与加工成熟
第三节 microRNA的特征和鉴别
第四节 microRNA的调控机理
第五节 microRNA的功能
第六节 microRNA、siRNA、piRNA及其他非编码RNA
第二章 microRNA的生物信息学研究方法
第一节 microRNA的生物信息学分析策略概述
第二节 microRNA序列信息的获取及相关数据库的建立
第三节 microRNA簇的分析策略
第四节 microRNA的种系发育分析
第五节 microRNA基因的转录调控分析
第三章 microRNA的分子生物学研究方法
第一节 microRNA表达分析方法
第二节 microRNA体外或体内水平的过表达研究
第三节 microRNA表达抑制研究
第四节 体外验证microRNA作用的靶基因
第五节 microRNA功能研究的策略
第四章 microRNA新基因的预测、克隆鉴定及注册
第一节 microRNA新基因的预测及注册程序
第二节 microRNA新基因的克隆及鉴定方法
第五章 microRNA表达分析方法
第一节 microRNA基因芯片分析
第二节 microRNAPAGE/NorthernBlot分析
第三节 microRNA的实时定量PCR检测
第四节 microRNALNAISH原位杂交
第六章 microRNA表达的干预方法——过表达
第一节 化学合成的microRNAmimics
第二节 真核系统过表达——非病毒载体瞬时表达载体的构建
第三节 microRNA腺病毒过表达系统
第四节 microRNA的慢病毒过表达系统
第七章 microRNA表达的干预方法——表达抑制
第一节 反义核酸分子的抑制策略——化学合成的microRNA抑制剂
第二节 基因水平的抑制策略
第三节 基于病毒表达系统的microRNA抑制策略
第八章 靶基因预测分析及萤光素酶双报告基因系统验证
第一节 生物信息学预测——microRNA靶基因分析软件的设计及使用
第二节 萤光素酶双报告基因系统的应用
第九章 microRNA研究方法在肝细胞癌研究中的应用
第一节 microRNA21在肝细胞癌中的功能研究简介
第二节 microRNA21在肝细胞癌中的功能研究所用实验材料与方法
第三节 miR21在肝细胞癌发生过程中的表达分析及功能研究
第四节 miR21在肝细胞癌发生及发展过程中的作用机制研究
第五节 miR21通过调控不同的靶基因在肝细胞癌发生过程中所发挥的功能研究
第六节 miR21对重要信号通路及功能基因的影响
第七节 microRNA在肿瘤研究中的分析与展望
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microrna在生活中都有哪些应用
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　　microRNA的应用从目前来看，个人觉得，主要可以分为这样几个类别：　　分子标记：通过监测细胞内的microRNA水平，来起到监测细胞器官状态、诊断疾病等作用。　　人工microRNA（Artificial microRNA，amiRNA）：利用microRNA的骨架和作用机制，来实现对预想基因的控制。　　基因修饰作物：通过分子生物学手段对基因组进行修饰，使得某些microRNA的水平上升或者下降，从而起到高效影响作物性状的功能。　　MicroRNA治疗或者microRNA拮抗剂治疗：通过输入人造的microRNA，或者与microRNA配对的分子，来提高或者降低体内microRNA的水平，从而起到调节下游基因表达，最终实现治疗效果。
采纳率：96%
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在microRNA的研究中，生物信息学发挥越来越重要的作用，以下是microRNA相关的数据库与预测、功能分析软件，绝对值得收藏。1.miRBase: miRBase序列数据库是一个提供包括已发表的miRNA 序列数据、注释、预测基因靶标等信息的全方位数据库，是存储miRNA信息最主要的公共数据库之一。miRBase提供便捷的网上查询服务，允许用户使用关键词或序列在线搜索已知的miRNA和靶标信息。2.miRecords: 动物 miRNA 的靶相互作用的数据库, 包括人工收集实验验证的, 预测的 miRNA的靶目标. 靶标预测工具DIANA-microT, MicroInspector, miRanda, MirTarget2, miTarget, NBmiRTar, PicTar, PITA, RNA22, RNAhybrid, and TargetScan/TargertScanS.3.PMRD: PMRD是一个关于植物MicroRNA 数据库，包括了microRNA序列和它们的靶基因、二级结构、表达谱、基因组搜索等等，并且该数据库尝试着整合大量的关于植物microRNA的数据。4.CoGeMiR: CoGeMiR数据库总结关于在进化过程中MicroRNA 在不同动物中的保守性。该数据库搜集已知的和预测的microRNA关于染色体定位、保守性和表达谱方面的信息。5.MicroRNAdb: MicroRNAdb是一个关于microRNA的综合性数据库。相比其他数据库，MicroRNAdb搜集的microRNA更完整且进行了充分的注释。如今，该数据库有732个microRNA序列的条目和439个详细的注释。6.miRWalk: miRWalkis是一个综合性数据库，提供来自人类、小鼠和大鼠的miRNA的预测信息和经过验证的位于其靶基因上的结位点。7.TarBase: TarBase数据库人工搜集了实验验证过的miRNA的靶基因，包括在人、小鼠、果蝇、蠕虫和斑马鱼中的miRNA的靶基因，区分出这些miRNA靶基因中的对的和不对的。8.miRGator:miRGator数据库是一个引导对miRNA进行功能阐释的工具。功能分析和表达谱结合靶基因预测，可以对miRNA的生物学功能进行推测。9.miRGen:miRGen是一个整合型数据库,包括：(i)动物miRNA和基因组元件之间的位置关系;(ii)通过结合广泛使用的靶基因预测程序得到动物miRNA靶基因。10.miRNAMap:miRNAMap数据库搜集了多个物种的经过试验证明的microRNA和miRNA靶基因，其中包括人类的、小鼠的、大鼠的以及其他多细胞动物的基因组。11.Vir-Mir:Vir-Mir数据库提供预测的病毒miRNA的候选发夹结构序列。12.ViTa:ViTa数据库搜集来自miRBase、ICTV、VirGne、VBRC等数据库的病毒数据，包括了已知的病毒的miRNA以及相应的由 miRanda和TargetScan预测的宿主miRNA靶基因。ViTa还提供有效的注释，包括人类miRNA的表达情况，病毒感染的组织等。13.ASRP Database:ASRP网站组织了拟南芥中的小RNA的信息，这些小RNA是通过ASRP或其他实验室分离得到的。14.miRNApath:miRNApath是一个关于miRNA、靶基因以及代谢通路的的数据库。15.miRex:miRex是一个分析microRNA基因表达的在线资源库，搜集，整理和分析已发表的关于microRNA基因表达的数据，它允许研究者通过数千数据点来分析基因表达和提供microRNA基因表达数据的在线保存。16.PolymiRTS:自然产生的miRNA的靶标位点DNA变异的数据库.17.SeqBuster:A bioinformatic web interface able to custom analyze deep sequencing data to study miRNA variants or isomiRs. From Genetic Causes of Disease Group, Genes and Disease Program, Centre for Genomic Regulation (CRG), Pompeu Fabra University, Barcelona, Catalonia, Spain.18.WMD3: WMD3 designs artificial microRNAs (amiRNAs). The 21mer amiRNA21mers can specifically silenceg single or multiple genes of interest in more than 90 plants. From Max Planck Institute for Developmental Biology, 72076 Tübingen, Germany.19.TargetScan:TargetScan是通过搜索和每条miRNA种子区域匹配的保守的8mer和7mer位点来预测靶基因。20.microRNA.org:miRanda数据库提供了关于人类、果蝇和斑马鱼基因组的microRNA靶目标的预测信息以及miRNA在不同组织的表达谱。21.PicTar: PicTar是通过一定计算法则来鉴定microRNA的靶目标的。该可搜索的网站可以提供以下物种的关于microRNA靶目标的预测详细信息，包 括：脊椎动物、七个果蝇种类、三个线虫种类和人类的非保守但共表达的microRNA的靶目标(例如：表达在同一组织的microRNA和mRNA)。22.RNAhybrid:RNAhybrid是一种用于寻找一条长链RNA和一条短链RNA的最小配对自由能的工具，是通过一种域码来实现的。例如一条短链序列结合到长链的最佳位置上。该工具主要作为microRNA靶基因预测用.23.microInspector:microInspector提供miRNA结合位点的预测。24.TripletSVM: TripletSVM是一个用于预测一个具有发夹结构的被查询序列是否是一个真正的miRNA前体物的程序.25.TransmiR: TransmiR是关于转录因子的microRNA调节的数据库，对于用于学术研究室免费的。26.miR2Disease:miR2Disease数据库是一个人工注释的数据库，主要收录的是与人类疾病相关的microRNA信息.27.S-MED: S-MED(肉瘤microRNA表达数据库)是一个存储miRNA表达谱的数据库，这些miRNA是在多种人的肉瘤中以及一些选择的正常组织中发现的。28.PMRD：植物microRNA数据库26.deepBase： deepBase从新一代测序技术(深度测序技术，deep-sequencing)数据中注释和鉴定microRNA，piRNA，siRNA基因及长非编码RNA基因及其他们的表达模式。30.starBase： starBase 从高通量的CLIP-Seq实验数据(CLIP-Seq和HITS-CLIP)和降解组实验数据中(degradome sequencing)搜寻micorRNA的靶标。提供了各式各样的可视化界面去探讨microRNA的靶标31.PITA: PITA基于靶位点的可接性(target-site accessibility)预测microRNA的靶标。32.RNA22：RNA22基因序列特征预测microRNA的结合位点。33.miRTarBase:一个全面收集已被实验验证的microRNA靶标数据库。34.miRanda： miRanda是John等于2003年5月开发的第一个miRNA靶基因预测软件。miRanda适用范围广泛，不受物种限制，同时提供了 windows,linux,和macintosh多平台版本，可以下载到本地运行。碱基互补方面，miRanda算法和Smith-Waterman算 法相似，但它以碱基互补(如A=U,G=C等)代替Smith-Waterman算法中的碱基匹配(如A-A,U-U等)来构建打分矩阵，允许G=U错 配，为了体现miRNA3’端和5’端和靶基因作用过程中的不对称性，软件给出了scale参数(5’端11个碱基得分值乘以该值，然后和3’端11个碱 基得分值相加作为碱基互补得分)。同时强调miRNA第2到4位碱基和靶基因精确互补，第3到12位碱基和靶基因错配不得多于5个，9到L-5(L为 miRNA总长)位碱基至少一个错配，最后5个碱基错配不得多于两个。35.DIANA-microT： DIANA-microT是KiriakidouM等基于实验和计算生物学方法开发的miRNA靶基因预测软件。和miRanda预测结果中可能出 现一个miRNA对应多个靶位点或多个miRNA对应一个靶位点而丢掉了miRNA调控单个靶位点不同的是，DIANA-microT考虑了miRNA调 控单个靶位点的情况。DIANA-microT预测算法基于以下两点来判别miRNA靶基因：①miRNA和靶基因间的高亲和力，主要通过结合能来衡量。 ②影响miRNA和靶基因所形成二聚体茎环结构环部位置和环大小的miRNA相关蛋白可能指导miRNA和靶基因的相互作用。36.RNAhybrid： RNAhybrid是Behmsmeier M等[15]基于miRNA和靶基因二聚体二级结构开发的miRNA靶基因预测软件。RNAhybrid预测算法禁止分子内、miRNA分子间及靶基因间 形成二聚体，根据miRNA和靶基因间结合能探测最佳的靶位点。尽管随着靶基因序列长度增加，运算复杂度也相应增加，但RNAhybrid和其它RNA二 级结构预测软件诸如mfold, RNAfold, RNAcofold和pairfold相比，仍具有明显的速度优势。此外，RNAhybrid允许用户自定义自由能阈值及p值，也允许用户设置杂交位点的 偏向，如杂交位点必须包含miRNA 5’端2-7nt等。转自:丁香园
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Copyright &microRNAMicroRNA（miRNA）是一类内生的、长度约20-24个的小RNA,是发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过加工后生成。其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。随着miRNA调控基因表达的研究的逐步深入，将帮助我们理解的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。miRNA广泛存在于中，是一组的短序列RNA，其本身不具有开放阅读框（ORF）。成熟的miRNA，5′端有一个，3′端为羟基。编码miRNAs的基因最初产生一个长的pri-RNA分子，这种初期分子还必须被剪切成约70-90个碱基大小、具发夹结构单链RNA前体（pre-miRNA）并经过Dicer酶加工后生成。成熟的miRNA 5’端的磷酸基团和3?端羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。miRNA 5＇端第一个碱基对U（尿苷）有强烈的倾向性，而对G却排斥，但第二到第四个碱基缺乏U。一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C。这些分子能够与那些和它的序列互补的相结合，有时候甚至可以与特定的DNA片断结合。这种结合的结果就是导致基因的沉默。这种方式是表达的一个重要策略。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。
形式/microRNA
1&. pre-miRNA&约70bp含microRNA茎环结构的pre-miRNA。制备方式：化学合成、生物转录合成、pre-miRNA质粒表达载体、pre-miRNA病毒。
2. pri－miRNA天然pri－miRNA&从染色体基因文库中调取300bp－1000bp完整的microRNA基因，克隆到质粒载体（普通载体或病毒载体），以强大的CMV启动子操纵该300bp－1000bp microRNA。人工pri－miRNA选择一个完整的microRNA基因，克隆到（普通载体或病毒载体）。以人工合成的约70bp含miRNA茎环结构的目标pre-RNA替代原pre-RNA，并以pol Ⅱ/pol III 启动子操纵该microRNA结构单元。
作用方式/microRNA
microRNA的形式&miRNA基因是一类高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分为三种：第一种以线虫lin-4为代表，作用时与靶标基因不完全互补结合，进而抑制翻译而不影响mRNA的稳定性（不改变mRNA丰度），这种miRNA是目前发现最多的种类；第二种以拟南芥miR-171为代表，作用时与靶标基因完全互补结合，作用方式和功能与siRNA非常类似，最后切割靶mRNA；第三种以let-7为代表，它具有以上两种作用模式：当与完全互补结合时，直接靶向切割mRNA，如果蝇和Hela细胞中let-7直接介导RISC分裂切割靶mRNA；当与靶标基因不完全互补结合时，起调节基因表达的作用，如线虫中的let-7与靶mRNA3?端非翻译区不完全配对结合后，抑制调节基因的翻译。
特异性/microRNA
研究表明MiRNAs在物种间具有高度的保守性、时序性和组织特异性——在特定的时间、组织才会表达。细胞特异性或组织特异性是miRNA表达的主要特点，又如中的miR-171仅在其花序中高水平表达，在某些组织低水平表达，在茎、叶等组织中却无任何表达的迹象；20-24h的果蝇胚胎提取物中可发现miR-12，却找不到miR3-miR6，在中表达的miR-1和let-7也无法在中表达，这同时体现了miRNA的又一特点——基因表达时序性。MiRNA表达的时序性和组织特异性暗示miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。siRNA是RNAi途径的主要作用物,miRNA和siRNA很容易混淆，他们有许多共同点也有许多不同点。为了能够清楚地让读者弄清两者之间的差异之处，笔者特别将它们之间的差别划分入三个大的阶段：起源阶段、成熟阶段和功能阶段（即调节基因表达的作用阶段）。
在描述两者的差异之前，有必要先说一说它们的共同点：
1．& MiRNA和siRNA都是由22个左右的核苷组成；
2．& 它们都是Dicer酶的产物；
3．& 它们在起干扰、调节作用时都会和RISC复合体结合；
4．& 它们都可以在转录后和翻译水平干扰以抑制靶标基因的翻译；
差异/microRNA
两者之间的主要差异：
起源阶段SiRNA：通常是外源的，如和人工插入的dsRNA被剪切后产生外源基因进入细胞（注：病毒入侵，或者是自身合成RNA中出现错误，细胞内就会产生，来阻止这些异常基因的表达）。MiRNA：是内源性的，是一种非编码的RNA；由miRNA基因表达出最初的pri-miRNA分子。
成熟过程SiRNA：直接来源是（通常为外源）；经过Dicer酶*切割形成双链siRNA,而且每个前体daRNA能够被切割成不定数量的siRNA片段。MiRNA：在细胞核中转录的较大的pri-miRNA经由Drosha(一种RNAse Ⅲ酶)和Pasha（含有双链RNA结合区域）加工成为单链pre-miRNA；接着，发夹状、部分互补的pre-miRNA在细胞质中被Dicer*（一种RNAse Ⅲ酶）酶切割形成miRNA；在生物体中的表达具有时序性、保守性和组织特异性。
siRNA：它与RISC*（RNA诱导的沉默复合物，使用的AGO蛋白家族的成分为AGO2）结合，以RNAi途径行使功能，即通过与序列互补的靶标mRNA完全结合（与编码区结合），从而降解mRNA以达到抑制蛋白质翻译的目的；它通常用于沉默外源病毒、转座子活性。
MiRNA:它和RISC形成复合体(利用的AGO蛋白家族成员为AGO1)后与靶标mRNA通常发生不完全结合，并且结合的位点是mRNA的非编码区的3’端；它不会降解靶标mRNA，而只是阻止mRNA的翻译； miRNA能够调节与生长发育有关的基因。注：RISC, RNA诱导的沉默复合物（RNA-induc RISC）的组装是在RNAi和miRNA通路中最为复杂的过程。新的研究表明，与siRNA和miRNA结合的RISC复合物并不完全相同其中的有AGO1和AGO2之分。刚产生的siRNAs和miRNAs都是双链结构，这种双链结构需要解螺旋才能被组装到RISC中发挥作用。组装后的复合物分别称为siRISC和miRISC。从dsRNA引发RNAi的发生大致划分为三个阶段，即启动、剪切和扩增。Dicer酶：新的研究表明siRNA成熟需要Dicer-2和蛋白，而miRNA则依赖Dicer1和它的伴侣loqs蛋白。
选择方法/microRNA
1.pre-miRNA是最早采用的microRNA，拥有大量的成功报道。化学合成的pre-miRNA制备快捷，可以标记荧光等追踪。缺点是制备的RNA稳定性较差，而且，由于制备的microRNA较长，合成时RNA的错误难以避免（当合成RNA超过60bp时，出现一个约30％），转录制备的pre-miRNA稳定性较好，但无flank结构，很少使用。形式的pre－miRNA也因为发现microRNA的flank对于microRNA功能和测定非常重要，现已逐渐被pri-miRNA取代。2.人工pri-miRNA效果较pre-miRNA好，也有足够多的成功使用的经验报道，但这种人工microRNA采用固定的mir155 flank，制备的microRNA功能不及天然原始microRNA，故也逐渐较少使用。3.原始天然pri-miRNA克隆自天然文库的microRNA由于保留了每个microRNA独自的，效果更好，是近来被首选方法。4.pre-miRNA或：可以转染大多数绝细胞，产品质量可靠。缺点是腺病毒有一定的毒性，以往实验腺病毒毒性并未引起重视，但我们发现在microRNA实验中显得比较突出。另外，制备周期长，费用高也是不容忽视的缺点。5.慢病毒microRNA：目前最好的microRNA实验产品，缺点是慢病毒自身的不足，即制备lenti－virus时，病毒的质量批间差异较大。AAV、或retrovirus microRNA：与腺病毒和lenti－virus microRNA一样，具有病毒产品的优势与缺点。
microRNA的检测/microRNA
越来越多的研究成果表明，miRNA&将在疾病，特别是癌症的诊断和治疗中起到积极的深远作用。与蛋白编码基因表达谱相比，用miRNA表达谱对癌症进行分型更加精确可靠。此外，在常规收集的、福尔马林固定、石蜡包埋的临床组织标本中，miRNAs都表现出较高的稳定性，更进一步预示其作为诊断性分子标记的巨大潜能。因此，研究特定细胞microRNA的表达图谱、筛选未知miRNA、探究每种miRNA的特定功能成为当前的研究热点。
目前常见的miRNA检测方法包括&Northern&Blot、微阵列芯片、微球、实时荧光定量PCR等技术，然而由于以下原因而各具缺陷。首先，由于miRNA本身碱基数过少，使得探针碱基序列的选择受限。并且不同microRNA&具有不同的最适杂交温度，在相同的杂交条件下，往往会引起很大程度的错配杂交，从而限制了对于相似序列microRNA的高效识别。其次，由于miRNA&存在序列的高度相似性，所以检测的特异性往往难以保证。
目前市场占主导地位的商品是Invitrogen&公司（原ABI公司）开发的实时荧光定量PCR方法（TaqMan&microRNA检测方法），该方法虽然在一定程度上克服了上述缺陷，但是仍具有高成本等缺点，限制了其广泛应用。
北京赛诺亚生物技术有限责任公司(www.sirnoa.com)自主开发出了方便实用的高通量miRNA检测方法：等温实时荧光定量miRNA检测&[1]。该技术具有高特异、高灵敏度、低成本等特点。而且，样品不需要经过特殊处理，可直接提取RNA后用来检测，检测灵敏度高达1000拷贝数；相对于市场上占主流的Invitrogen&TaqMan&miRNA检测方法，该方法在成本和特异性等方面具有明显优势。
参考资料/microRNA
[1] 生物通 http://www.ebiotrade.com/custom/ebiotrade/7th/
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