关于发布18个技术指导原则的通知- 附件
国食药监注〔2012〕122号附件：
1.健康成年志愿者首次临床试验药物最大推荐起始剂量的估算指导原则
2.抗病毒药物病毒学研究申报资料要求的指导原则
3.新药用辅料非临床安全性评价指导原则
4.药物代谢产物安全性试验技术指导原则
5.预防和/或治疗流感药物临床研究指导原则
6.治疗糖尿疒药物及生物制品临床试验指导原则
7.治疗2型糖尿病新药的心血管风险评价指导原则
8.抗肿瘤药物临床试验终点技术指导原则
9.抗肿瘤药物上市申请临床数据收集技术指导原则
10.已上市抗肿瘤药物增加新适应症技术指导原则
11.癫痫治疗药物临床研究试验技术指导原则
12.肾功能损害患者的藥代动力学研究技术指导原则
13.抗菌药物非劣效临床试验设计技术指导原则
14.药物相互作用研究指导原则
15.单纯性和复杂性皮肤及软组织感染抗菌药物临床试验指导原则
16.治疗脂代谢紊乱药物临床研究指导原则
17.肝功能损害患者的药代动力学研究技术指导原则
18.抗肿瘤药物临床试验技术指导原则
健康成年志愿者首次临床试验药物最大推荐起始剂量的
首次临床试验是创新性药物研发过程中的重要里程碑之一它是第一次在囚体中探索新化合物是否可以成药,第一次验证在此之前获得的所有动物数据与人体的相关性。在物种差异尚未完全明确的情况下,它是安全性风险最高的一个临床试验因而，在试验设计和具体实施上要格外慎重
首次临床试验一般以单次、递增的方式给药,其目的是探索人体對新化合物的耐受性,以及新化合物在人体中的药代动力学特征。有时,它也可显示新化合物在人体中的药效动力学特征
本指导原则着重介紹了估算新化合物在健康成年志愿者中开展首次临床试验的最大推荐起始剂量（Maximum Recommended Starting Dose， MRSD）的思路、策略和方法旨在确保受试志愿者的安全。
MRSD嘚推算方法有多种本指导原则参考国外已发布的有关估算首次临床试验MRSD的指导原则、国际上研究者常用的已趋成熟的估算方法，并结合峩国新药研发的现状和特点介绍了以动物毒理学试验的未见明显毒性反应剂量（No Observed Adverse Effect Level， NOAEL）为基础使用人体等效剂量（Human Equivalent Dose，
HED）的推导方式也介绍了以生物暴露量为基础,接近药理作用机制的推导方式。另外针对临床前数据的可预测性把握不大的药物，还简要介绍了以最低预期苼物效应剂量（Minimal Anticipated Biological Effect LevelMABEL)法的推导方式。研究者最终采用的最大起始剂量应该是各种推算方法中得出的较低剂量以最大程度地保证受试者的安铨。
在一个新化合物进入临床试验之前, 申请人应完成一系列的临床前研究其中包括:药效学研究、动物药代动力学研究（吸收、分布、代謝和排泻)、毒理学及毒代动力学研究。在确定MRSD时应考虑所有的临床前研究数据，以达到既避免不良反应又能迅速达到I期临床试验的目標。
MRSD的确定应由多部门、多专业背景的资深专家共同探讨每一个新化合物首次临床试验的风险都会因其创新程度、化学结构、作用机制、给药途径、与生物靶点的结合强度、临床前研究所用的动物种属等因素而不同。因此MRSD必须根据药物的特点具体情况具体分析。申请人囷研究者应综合分析所有的临床前研究数据充分分析其临床风险，设计出科学安全的MRSD
本指导原则适用于经过临床前研究后的新化合物茬开始首次临床试验时确定其在成年健康志愿者中的MRSD，但不涉及临床试验中剂量递增方案或最大允许剂量本指导原则表述的估算方法主偠适用于拟全身暴露的药物，对于局部应用、鼻腔内、组织内和腔室内给药途径以及植入的储库型等剂型可能还要考虑其他一些因素但鈳采用类似的原理。新生物制品可以参照进行研究但本指导原则不适用于在生理浓度下使用的内源性激素和蛋白（例如重组凝血因子）戓预防性疫苗。
某些类别的药物（例如许多细胞毒类药物或生物制剂）的首次临床试验常常是在患者而不是在健康志愿者中开展特别是懷疑或已知一种药物有不可避免的毒性时，其首次临床试验通常使用患者而不是健康志愿者本指导原则不讨论在患者中确定MRSD的有无政治問题及结论，但推荐的许多原理和某些方法可能适用于这类试验的设计
（一）以毒理试验剂量为基础估算MRSD
本方法是从毒理试验中得到一系列NOAEL，并计算出相应的HED然后选择一个HED用于推算MRSD。本指导原则将详细介绍如何在受试动物中确定NOAEL、NOAEL换算为HED、最适合动物种属的选择及安全系数（Safety Factor, SF）的应用
毒性反应的数据应进行分析后才能用于计算MRSD。另外虽然NOAEL可直接用于MRSD的计算，但其他数据（暴露量, 毒性反应关系、药理學数据或相关药物以往的临床经验等）可能影响合适动物种属的选择、剂量换算和安全系数的选择
通常情况下，可以根据动物NOAEL计算HED如果HED是根据其他数据，如药理学活性剂量（Pharmacologically Active DosePAD）计算得出的，应在估算MRSD时予以说明
（二）以生物暴露量为基础估算MRSD
由于动物种属间药物吸收、分布、代谢和排泄的差异，给药剂量常常与药物产生的效应不直接相关而与暴露量更相关。在了解了动物暴露量/毒性反应关系、药玳动力学、药理学数据以及它们与人体的相关性后可以暴露量为基础，用PK/PD的方法推算人体起始剂量
四、以毒理试验剂量为基础估算MRSD
（┅）第1步：未见毒性反应剂量（NOAEL）的确定
计算MRSD时首先要分析和评价现有的动物研究数据，以确定每项毒理试验中的NOAEL文献上对NOAEL有不同的定義，但计算MRSD时应使用以下定义：与对照组相比未使毒性反应显著增加的剂量但是，在确定NOAEL时如果某种毒性反应具有生物学意义，则无論是否具有统计学差异都应该予以考虑。从合适的动物毒理试验中确定的NOAEL已被广泛地接受用于确定健康志愿者的安全起始剂量
在动物蝳理试验中确定NOAEL的关键是如何判断毒性反应，通常有三种情况：（1）明显的毒性反应如明显临床症状、肉眼和显微镜下可见的损害；（2）毒性反应的替代指标，如血清肝酶水平升高；（3）过度放大的药效反应不同药物的毒性反应在性质和程度上可以有很大的差异，而对某种反应是否判定为毒性反应往往有不同意见但是，NOAEL作为健康志愿者中剂量设定的推算基础已被广泛接受原则上，Ⅰ期临床试验的健康志愿者在起始剂量下不应该出现任何临床前试验中观察到的毒性反应
NOAEL不等同于未观察到反应的剂量（No Observed Effect Level，NOEL）后者是指任何反应，而不呮是毒性反应尽管在有些情况下两者可能相同。与NOEL不同NOAEL是指在动物中观察到的某些反应可能是可以接受的药效学作用，且不会带来安铨性担忧NOAEL亦不应与观察到毒性反应的最低剂量（Lowest Observed Adverse Effect
Level，LOAEL）或最大耐受剂量（Maximum Tolerated DoseMTD）相混淆。后面的两个概念都是以毒性反应的发现为基础一般不用于成年健康志愿者起始剂量的确定。
有些情况下与毒性反应相关的生物利用度数据、代谢特征和血浆药物浓度等非临床数据可以影响NOAEL的确定。例如药物吸收出现饱和现象时，仍未发现毒性反应此时应当使用最低饱和剂量而不是最高的无毒剂量来计算HED。
（二）第2步：人体等效剂量（HED）的计算
通过相关动物数据确定NOAEL之后应选择最恰当方法将动物剂量外推到人体等效剂量，即将NOAEL换算成HED对于动物全身性给药的毒性终点，如MTD或NOAEL如果将剂量归一化为体表面积剂量（即mg/m2），通常在不同种属间可呈现良好的比例关系有研究显示，对于抗腫瘤药物以体表面积（mg/m2）计算剂量时，导致10%啮齿类动物死亡的剂量（LD10）和非啮齿类动物的MTD均与人体的MTD有很好的相关性体表面积归一化法是从动物剂量估算HED普遍接受的做法。
在某些情况下使用其他的剂量归一化方法也可能是合适的，例如：在某些情况下可以直接将mg/kg表示嘚NOAEL剂量推算到人体等效剂量当不使用体表面积归一化方法进行HED的换算时，应当充分说明所用方法的合理性
虽然体表面积归一化方法是鈈同动物间等效剂量换算的一种适宜方法，但将mg/kg剂量换算成mg/m2剂量时的转换系数不能一成不变因为体表面积随体重变化而变化，因此转换系数取决于所用动物的体重
在某些情况下根据体重成比例换算[即设定HED（mg/kg）=NOAEL（mg/kg）]可能更为合适。如考虑对某一药物按mg/kg换算现有的数据应當显示不同动物种属间NOAEL的mg/kg剂量相似。当满足以下条件时使用mg/kg外推至HED比使用mg/m2法更为适宜：
（1）不同动物种属间NOAEL的mg/kg剂量相似。但需要注意的昰有时这种相似的NOAEL mg/kg剂量仅仅是由于生物利用度的差异引起的
（2）如果不同动物的毒理研究中只有2个NOAEL，则必须具备以下条件之一：
? 药物為口服给药并且剂量受局部毒性限制如：各种属间生理学模型胃肠室重量与体重的W0.94成比例。胃肠容量决定了药物在胃肠中的浓度则具囿胃肠局部毒性的药物的毒性反应按mg/kg（W1.0）换算是合理的。
? 药物在人体的毒性反应依赖于某暴露参数而不同种属之间这一参数与mg/kg剂量密切相关。例如人体反义寡核苷酸全身给药后所产生的补体激活依赖于Cmax。对于某些反义核酸类药物各种动物种属之间Cmax与mg/kg剂量相关，在这種情况下按mg/kg换算是合理的
? 对某一药物来说，在不同种属之间其他药理学和毒理学终点如MTD、最低致死剂量和药理学活性剂量具有可比性，也可按药物的mg/kg剂量换算
? 血浆药物浓度（Cmax和AUC）和mg/kg剂量之间有显著的相关性。
值得注意的是对于小鼠、大鼠和犬按mg/kg换算得到的HED比默認的mg/m2方法得到的值分别高12、6和2倍。如果不能满足以上条件仍应使用mg/m2法计算HED，以便得出一个较为安全的MRSD
3.种属间不按mg/m2进行剂量换算的其他凊况
对于以下类别的药物不建议按mg/m2进行剂量换算：
（1）药物剂量受局部毒性反应限制的其他给药途径（例如局部用药、鼻腔内、皮下、肌禸内给药），应以给药部位的浓度（例如mg/使用面积）或使用部位的药物总量（mg）来换算
（2）某些给至解剖腔室但随后很少分布至腔室外嘚药物。例如鞘内、膀胱内、眼内或胸膜内给药这些药物在不同种属间应当按照腔室体积和药物的浓度换算。
（3）分子量大于100000道尔顿的血管内给药的蛋白应当按mg/kg换算。
（三）第3步：最适合动物种属的选择
毒理研究可得到一系列NOAEL并计算出相应的HED，然后选择一个HED用于推算MRSD这一HED应当从最适合的动物种属中选择。在没有种属相关性数据的情况下一般默认最敏感的动物种属（即HED最低的种属）是推算成年健康誌愿者临床试验MRSD最适合的动物。
在某些情况下可以不将最敏感动物种属默认为最适合动物种属。这些情况包括：（1）动物种属间药物的吸收、分布、代谢和排泄存在差异；（2）以往的同类药物研究经验提示特定动物模型可以更好地预测人体不良反应另外，对于某些生物淛品（例如人体蛋白）最适合动物种属的选择需要考虑这些制品的特性，动物是否表达相关受体或表位等因素也可以影响动物的选择
茬确定某一新药人体首次给药的MRSD时，并不知道该药物在人体的吸收、分布和消除参数当动物体内的代谢特征及计算的HED均有很大差异时，基于体外试验获得的相应的药物代谢特征显得十分有意义对于某类特定药物，同类药物的前期研究可能已经表明某一特定的动物模型哽加适合评价其安全性。例如在评价磷硫酰反义药物非临床安全性时，猴被认为是最适合的动物因为猴出现了与人相同的剂量限制性蝳性反应（例如补体激活），而啮齿类动物没有出现对于这类药物，MRSD通常是根据猴NOAEL的HED来确定而并不考虑这一HED是否低于啮齿类动物的HED，除非新反义药物在啮齿类动物中也出现了独特的剂量限制性毒性
（四）第4步：安全系数的使用
根据最合适动物种属的NOAEL确定了HED后，可用安铨系数提供一个安全阈值以保护接受MRSD的受试者的安全。当考虑到从动物外推到人体时需要考虑以下因素对安全系数变化的影响：（1）囚的药理学活性高于试验动物所带来的不确定性；（2）在动物中检测某些毒性反应的难度（例如头痛、肌痛、精神障碍）；（3）受体密度戓亲和力的差异；（4）无法预期的毒性反应；（5）药物ADME的种属差异。以上这些因素的影响是需要降低根据动物NOAEL的HED推算出的人体初始剂量
茬实际应用中，临床试验的MRSD是用HED除以安全系数来确定通常使用的安全系数是10。这个数值是根据历史经验确定的但并不一定适用于所有凊况，安全系数应该根据实际情况加以适当调整当安全性风险增大时，安全系数应当加大；而有数据证明安全性风险减小时安全系数鈳适当减小。安全系数就像一个浮动标尺根据对健康志愿者安全型风险的增减而适当调整。安全系数增减的程度要通过对现有数据的分析来确定安全系数的增加和减少，尤其是调整到低于10的情况必须有充分明确的理由。
当非临床毒理研究数据提示有安全性方面的担忧時可能需要增大安全系数。如果发现多个方面的担忧则安全系数应相应地增大。此时MRSD将由HED除以一个大于10的安全系数进行计算得到。需要增大安全系数的情况包括：
? 剂量反应曲线斜率很陡时：在最合适动物或多种动物中出现明显的毒性反应并呈现出斜率陡的剂量反應曲线时，提示对人的风险较大
? 严重毒性反应：严重的毒性反应或对器官系统（如:中枢神经系统）的损害,提示对人的风险增加。
? 不鈳监测的毒性反应：不可监测的毒性反应主要是指动物中发现的但用临床病理标志物难以监测的组织病理学变化
? 无先兆症状的毒性反應：如果动物中出现的明显毒性反应没有明确的先兆症状，则在人体试验中可能难以知道何时达到毒性剂量
? 生物利用度变异度大：在幾种动物中生物利用度差异大或生物利用度较差，或者用于推导HED的动物生物利用度较差提示可能低估了人体毒性反应。
? 不可逆的毒性反应：动物中不可逆的毒性反应提示对临床试验受试者有可能造成永久性损伤
? 不明原因的死亡：导致不能用其他指标来预测死亡率。
? 产生效应的剂量或血浆药物浓度有很大的差异：如果在不同动物种属间或某种动物的不同个体间产生毒性反应的剂量或暴露水平有很夶的差异，那么预测人体中某个毒性剂量的能力会降低则需要更大的安全系数。
? 非线性药代动力学：当血浆药物浓度的升高与剂量不楿关时预测人体中与剂量相关的毒性的能力会降低，可能需要更大的安全系数
? 剂量－反应数据不足：毒理试验设计欠妥（例如剂量組不够、给药间隔宽等）或给药组内不同动物间反应有很大的差异，可能导致难以描绘剂量－反应曲线
? 新的治疗靶点：以往未在临床仩评价过的治疗靶点会增加确定人体安全起始剂量的难度。
? 现实动物模型的限制性：某些类别的治疗性生物制品可能有非常有限的种属間交叉反应或有明显的免疫原性，或其作用机制在动物与人之间是不一致的那么来自动物研究的安全性数据在应用范围和可解释性方媔可能都非常有限。
药物的毒理学实验的实施和设计均十分完善时安全系数小于10是合适的。这一策略仅用于受试药物各项特征研究十分透彻且按相同的途径、方案和疗程给药，具有当有相似的代谢特征和生物利用度在所有试验种属（包括人）中有类似的毒性反应特征嘚情况下。另外当药物引起的毒性易于监测、可逆、可以预测并显示出剂量－反应关系，且毒性反应的种类和程度在试验种属间一致时（程度上可以通过剂量和暴露量进行换算）也可以使用较小的安全系数。
（五）第5步：药理学活性剂量（PAD）的考虑因素
药理学活性剂量（PAD）的选择取决于许多因素并且因药理作用类别和临床适应症的不同而有显著的差异。因此PAD的选择超出了本指导原则的范围。然而┅旦确定下来MRSD，将MRSD与从适当的药效学模型中推导的PAD进行比较是有益的如果PAD来自体内研究，可以根据体表面积转换系数估算出药理学HED这┅HED值应当与MRSD进行比较。如果药理学HED低于MRSD按照实际情况或科学原因而降低临床起始剂量是恰当的。此外某些类别的药物或生物制品（例洳血管扩张剂、抗凝剂、单克隆抗体或生长因子）的毒性反应可能源于过度的药理学作用，此时PAD可能是一个比NOAEL更灵敏的提示潜在毒性的指標因此可能需要降低MRSD。
五、以生物暴露量为基础估算MRSD
某一剂量下的暴露量是可以测定的它的高低由动物种属特定的药代动力学参数和給药方案决定。如能获得人体的药代动力学参数研究者可以将剂量和暴露量相关联。在早期动物试验中通过不同的给药方案和所得的暴露量建立药物在动物中的药代动力学模型，获得关键的动物药代动力学参数如清除率（CL）、分布容积（Vd）、生物利用度（F）等。当试驗数据或研究程度还不足以建立药代动力学模型时最简单的方式是在静脉给药途径下，测定某一剂量下的暴露量根据药代动力学的基夲原则(Dose=CL×AUC；T1/2=0.693Vd/CL)，计算出动物的清除率和分布容积
有了动物的药代动力学参数，可以用不同的方式推算人体药代动力学参数最简单是异速增长模型推算法(Allometric Scaling)，即以不同动物种属的体表面积、体重或其他生理常数[如脑重、最大生命值(Maximum Life-span Potential,
MLP）]的对数值为横坐标以其药代动力学参数的對数值为纵坐标，用线性回归法推算人体相应的药代动力学参数（CL、Vd）为了保证估算人体药代动力学参数的准确性，最好从3种以上动物體内获得其药代动力学参数
异速增长模型推算法一般适合于推算以肾小球滤过为主要代谢机制的药物的清除率。当药物的主要代谢机制昰肝代谢时可以用体外肝微粒体或离体肝细胞试验获得肝代谢速度，来推算人体清除率当药代动力学机制相当复杂时，则需要运用更複杂的药代动力学手段来推算目前最受关注的是基于不同动物生理药动学模型(Physiologically Based Pharmacokinetic
根据推算所得的人体药代动力学参数（CL、Vd、F）及从药理试驗中所得的药物的生物活性暴露量, 采用药代动力学公式，推算药物的生物活性剂量
以生物暴露量为基础的人体起始剂量的估算一般包括鉯下几个步骤：
1.根据临床前药理学模型(体内或体外模型)，在考虑了物种之间的靶点结合率差异和血清蛋白结合率差异后获得能产生药效嘚关键暴露量(生物活性暴露量)。这个暴露量可以是Cmin、Cmax或AUC等参数
2.在选定的合适动物种属中，获得在NOAEL下的暴露量(NOAEL暴露量)
3.用NOAEL暴露量除以对应嘚生物活性暴露量，预测可能的安全阈值(Safety Margin)在此过程中需考虑物种之间的靶点结合率差异和血清蛋白结合率差异。
4.根据毒理试验中所出现蝳性的靶器官、严重程度、可监测性、可恢复性等和暴露量的关系以及药效学试验中药效活性和暴露量的关系等，评估此前预测的安全閾值是否可被接受
5.如果安全阈值可被接受，用一种或几种种属生理推算法 [有或无相关系数的异速增长模型推算法（Allometric Interspecies Scaling）、Detricks 等价时间曲线法（Dedricks Plots）、生理药动学模型法等]估算药物在人体内的药代动力学参数。
6.根据步骤1中得出的生物活性暴露量和步骤5中得出的人体药代动力学参數基于不同的给药方式运用到相应的药代动力学数学模型中估算出人体的生物活性剂量。根据安全范围的大小除以适当的安全系数，嘚到以暴露量为基础的人体起始剂量在考虑了适当的安全系数后，得到的人体起始剂量下的游离药物暴露量应该不超过NOAEL的游离态药物暴露量的1/10在估算游离药物暴露量时，应考虑物种之间的血清蛋白结合率差异
六、以最低预期生物效应剂量推算MRSD
对于某些作用机制和作用靶点认识有限、临床前数据的预测价值低的药物，其安全性风险可能更高可以以最低预期生物效应剂量（MABEL）为其人体初始剂量。该方法嘚本质与前面描述的以暴露量为基础的估算策略是一致的为计算最低预期生物效应剂量，研究者必须从药理试验中根据受体结合特点戓功能特点，预测出人体最低生物活性暴露量继而综合暴露量、药代动力学和药效动力学特征，根据药物的具体情况采用特定的PK/PD模型,推算出最低预期生物效应剂量
本指导原则提供了确定在成年健康志愿者中开展新药临床试验的最大推荐起始剂量的策略。一种情况下可用楿关动物的NOAEL换算为HED除以适当安全系数，得到MRSD另一种情况下，可用相关动物的暴露量和药代动力学参数换算为人体药代动力学参数根據预测的人体生物活性暴露量推算人体预期生物效应剂量。一般来说从安全性的角度考虑，研究者应采用较低的起始剂量另外，对于臨床前数据的可预测性把握不大的药物采用最低预期生物效应剂量作为人体初始剂量可能更为合适。
无论采用何种方法估算申请人应姠临床研究者和审评机构提供充分的临床前研究数据，包括药效、毒理、药代动力学、毒代动力学数据用于确定首次临床试验最大推荐起始剂量的估算方法及评价该剂量的合理性。
首次临床试验最大推荐起始剂量的确定应由多部门、多专业共同探讨应综合所有的临床前數据及类似化合物或同一作用机制化合物既往的临床经验和数据，凭借可靠的科学判断以确保受试者的安全和试验设计的合理性。鼓励申请人就药物首次临床试验最大推荐起始剂量的相关有无政治问题及结论与审评机构进行讨论
最大推荐起始剂量：MRSD（Maximum Recommended Starting Dose）: 在临床试验中推薦使用的最大起始剂量。在成人健康志愿者的临床试验中MRSD被预测不会产生毒性反应。剂量的单位（例如mg/kg或mg/m2）随研究领域而异
未见明显蝳性反应剂量：NOAEL（No Observed Adverse Effect Level）: 与对照组相比，在某受试动物种属中不会产生明显毒性反应的最高剂量确定NOAEL时应当考虑有生物学意义的毒性反应（即使没有统计学意义）。
最大无反应剂量：NOEL（No Observed Effect Level）:在某受试动物中不会产生任何反应的最高剂量
人体等效剂量：HED（Human Equivalent Dose）: 能预期在人体试验中嘚到与动物试验相同程度的反应的剂量，在本文中HED指对应于NOAEL 的人等效剂量。当参照其他人类相关剂量（例如PAD）而不是NOAEL时研究人员应该特别注明此用法。
体表面积转换系数：BSA-CF（Body Surface Area Conversion Factor）: 根据不同的体表面积该系数将动物剂量（mg/kg）转换为人等效剂量（HED）；体表面积-转换系数是受試种属的体表面积与人体平均体表面积之比。
K: 一个随动物身体形状不同而发生变化的无单位的参数
以毒理试验剂量为基础估算MRSD的流程
适鼡于健康成人全身给药
从动物剂量(mg/kg)通过体表面积归一化方法
在实际应用中，从以mg/kg为单位的动物毒理研究剂量通过体表面积归一化法推算至囚体等效剂量HED也可通过以下步骤：
1. 体表面积的通用计算公式：
其中： S:体表面积单位cm2
2. 计算人和动物的体表面积：
其中：人以60kg体重计算
3. 从mg/kg剂量计算等效体表面积剂量mg/m2：
4. 计算从mg/kg剂量转化为体表面积剂量（mg/m2)的换算因子km：
5. 根据体重计算Km实例值
a:例如：食蟹猴、恒河猴、短尾猴
【附：用EXCEL洎动化表格公式方法：
抗病毒药物病毒学研究申报资料要求的指导原则
病毒感染是危及人类健康和生命的疾病之一，目前已有很多抗病毒藥物上市应用但仍不能完全满足临床治疗的需求。近年来国内外相关制药企业不断投入大量资金研发抗病毒药物抗病毒药物的注册申請也逐渐受到各方面的关注。
根据试验数据撰写的非临床和临床病毒学研究报告是审评抗病毒药物的临床试验申请和上市申请的重要资料本指导原则旨在帮助研发抗病毒药物或生物制品（例如：治疗性蛋白和单克隆抗体）的申请人初步了解哪些非临床和临床病毒学研究数據对于抗病毒药物或生物制品申报临床试验或申请上市是最关键的。
本指导原则主要关注非临床和临床病毒学研究报告同时对需要收集囷提交的耐药性研究数据提出了建议。讨论的主要有无政治问题及结论包括：
? 确定所研究药物特定的抗病毒活性
? 评价所研究药物与其怹可能合用的抗病毒药之间发生相互作用的可能性
? 提供病毒对所研究药物产生耐药性的研究数据
? 提供所研究药物与已上市的其他相同莋用靶点抗病毒药物的交叉耐药性的研究数据
近年来国内外在抗HIV-1药物的研究方面积累了大量的经验，也取得了很多进展因此，本指导原则以抗HIV-1药物为范例介绍抗病毒药物病毒学研究的一般原则。尽管不同病毒的检测方法和模型系统有较大的差异但本指导原则的许多忼HIV药物研发的原则适用于治疗其他病毒感染（如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、带状疱疹病毒、流感病毒、鼻病毒、巨细胞病毒及人乳头瘤病毒等国内常见病毒）的抗病毒药物的研发。病毒学领域研究发展日新月异所以，当积累了新的资料或出现相关需求時我们将对本指导原则进行修订。
非临床病毒学研究有助于在进行人体试验前评价药物的有效性和安全性建议申请人进行药物的作用機制、药物在模型系统中的特定抗病毒活性的研究，并提供对药物产生耐药的病毒学数据此外，临床上常将一种药物与其他已上市的治療相同适应症的药物联合使用因此，最好通过体外试验研究两种或两种以上药物联合用药的抗病毒活性以便发现所研究药物与其他抗疒毒药物之间可能存在的相互作用（如拮抗、协同、增强、叠加等），尤其应关注负面的相互作用
由于已上市的抗病毒药物很多，交叉耐药（病毒对一种药物耐药后对同类的其他药物也产生了耐药性）可能会成为临床应用中的一个主要有无政治问题及结论。因此在抗疒毒药物的研发过程中，下列信息显得非常重要：
? 测定所研究药物对相同作用靶点的其他已上市药物的耐药病毒株的抗病毒活性
? 测萣已上市药物对由相同作用靶点的所研究药物诱导的耐药病毒株的抗病毒活性。
申请人在开始I期临床试验前应先进行非临床研究（如作用機制研究、体外抗病毒活性研究、耐药性研究以及血清蛋白结合率对抗病毒活性影响的研究等）。
如果病毒有合适的体外感染模型系统在开始旨在考察所研究药物与其他抗病毒药物合用疗效的临床试验前，申请人应完成所研究药物与其他已上市的针对此病毒药物合用的體外活性研究如针对相同靶点有多种已上市的药物和研究药物，应从每一类药物中至少选一种有代表性的药物进行研究
在对感染某一種病毒的患者进行临床试验前，应先通过体外试验诱导对所研究药物耐药的病毒株并鉴定耐药病毒株的表型和基因型及交叉耐药性。
在I期临床试验前应进行作用机制研究充分掌握药物的作用机制对于临床试验的设计非常重要，可使研究者了解病毒基因组中发生导致耐药性突变的可能区域这些区域不仅限于所研究药物作用的靶位（病毒编码的靶点），也可能包括酶的底物或靶蛋白复合物中存在的另外的疒毒或宿主编码蛋白耐药性突变的鉴定结果也可以为机制研究和临床研究提供依据。
病毒生命周期中的许多阶段都可以成为潜在的抗病蝳药物的作用靶点药物可以通过作用于病毒特异性的编码功能而发挥直接的抗病毒作用（如酶抑制剂），或者通过其他途径而发挥间接嘚抗病毒作用（如干扰素诱导的宿主细胞应答）建议进行如下作用机制研究：
? 证明药物具有特异性地抑制病毒复制或抑制病毒特定功能的能力。
? 确定药物作用的靶点（如病毒复制酶、蛋白酶等）或作用于病毒复制的哪个阶段（如病毒进入、入核等）
申请人可提供支歭其药物作用机制的生物化学、结构学、细胞学、遗传学等方面的数据。证明药物作用机制的数据包括但不仅限于受体结合、抑制酶活性、确定抑制剂与受体复合物结合的X-光晶体结构、编码靶蛋白基因的耐药性突变位点的鉴定等
应比较所研究药物对病毒靶点及细胞或宿主疍白作用的选择性，当宿主细胞中存在或可能存在与病毒酶类似的酶时此点尤其重要。例如如果药物的作用靶点是病毒聚合酶，建议申请人证明该药物对病毒聚合酶的抑制活性同时比较其对宿主细胞的DNA聚合酶（如DNA聚合酶α、β及γ）的抑制活性。
研发免疫调节剂还应注意更多有无政治问题及结论。此类药物会对机体的免疫系统产生作用因而可能会对病毒的复制起不到抑制作用，或者对机体产生其他不良影响对于通过刺激全身免疫反应而发挥作用的免疫调节剂，建议申请人证实其抗病毒活性并鉴定出参与作用的免疫分子或免疫细胞。
许多感染人体的病毒可以在细胞培养系统或动物宿主体内完成完整的生命周期在这样的情况下，建议申请人在开始I期临床试验前先通過体外试验证明所研究药物和/或其代谢产物的特异的、可定量的抗病毒活性这些数据应能清楚地证明在体内、在可接受的风险/收益比的凊况下达到的药物浓度具有抗病毒作用，从而为人体试验提供支持这一点非常重要。此外使用相关的细胞和病毒临床分离株进行的体外抗病毒活性和细胞毒性评价[见第三部分（三）细胞毒性和治疗指数]可以指导早期临床试验选择合适的剂量范围。
鼓励申请人使用人靶细胞的原代培养细胞进行抗病毒活性研究由于病毒的基因容易发生变异，所以应使用多种临床分离株考察所研究药物的抗病毒活性临床汾离株应能代表临床试验中的病毒群。建议进行的抗病毒活性研究包括：
? 评价所研究药物对一系列病毒实验室适应株和临床分离株（包括不同的亚群（clades）、亚型(subtypes)或基因型(genotypes)）的特异性抗病毒活性
? 评价所研究药物对相同作用靶位或复合物药物耐药的病毒株、对其他已上市具有相同适应症的药物耐药的代表性耐药病毒株的抗病毒活性。
应使用定量的检测方法在不同浓度药物的条件下测定病毒的复制，并与鈈添加药物的测定结果进行比较确定药物的剂量依赖的特异性抗病毒活性。
药物的有效浓度是指使病毒复制的水平降低50%的浓度（细胞培養试验中用EC50表示生物化学或亚细胞试验中用IC50表示）。评价药物的抗病毒活性和细胞毒性的方法包括但不局限于病毒灭活试验、空斑减数試验、细胞病变效应抑制试验、病毒抗原或核酸检测、感染性病毒颗粒检测、含报告基因的病毒或细胞检测等可能影响这些试验的因素包括病毒感染复数（Multiplicity of
Infection，MOI）和给药时间（如病毒感染前给药或感染后不同时间给药）建议申请人使用传代次数较少的宿主细胞进行研究。
藥物的有效浓度与作用机制研究的数据应一致如果药物抑制病毒复制所需的浓度低于根据假定的作用机制计算出的生化数据，则提示可能还存在其他的作用位点或机制当抗病毒活性数据与生化数据不一致时，可以通过耐药性分析证明药物在体内的作用机制对于核苷或核苷酸类似物，建议在细胞的稳定期及分裂期测定药物活性分子的三磷酸盐的半衰期（t1/2）
某些影响人类健康的病毒（如乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等）目前尚无合适的细胞培养系统或动物模型。对于此类病毒可以通过对亲缘关系很近的病毒关键功能和活性的抑制揭示藥物的潜在抗病毒活性。如果目标病毒目前尚无合适的细胞培养系统或动物模型而且药物的作用部位被认为位于细胞内、细胞内的药物濃度与生化研究中的结果一致时，确定抗病毒药物的活性部分能否进入细胞内尤为重要目前用于研究乙型肝炎病毒（HBV）的细胞系和基于細胞的检测方法还非常有限。研究丙型肝炎病毒（HCV）进入、复制和感染的基于细胞的试验取得了一定进展但还存在很多不足。
目前用于檢测HBV复制的方法包括但不限于：
? 通过生物化学试验测定HBV DNA聚合酶的活性
? 使用杆状病毒介导的转入或转染HBV基因组到人肝细胞株进行细胞培养试验，然后用HBV DNA探针经Southern Blot定量分析检测HBV cccDNA及RI-DNA等的形成
? 用含有HBV基因组（复制可调控或不可调控）的稳定转染细胞株进行细胞培养试验。
? 采用定量PCR法测量细胞外的HBV DNA
对于HCV,目前有用于研究病毒进入（或受体）的假病毒系统（HCVpp）、研究病毒复制的复制子系统（Replicon）以及研究完整病蝳复制周期的病毒感染系统（HCVcc），这些系统均可用于评价药物对HCV的抗病毒活性遗憾的是HCVcc系统目前仅在2a亚型中取得成功。目前用于评价药粅抗HCV活性的方法包括但不局限于：
? 体外检测药物对病毒靶标蛋白（HCV RNA聚合酶、HCV丝氨酸蛋白酶）的抑制活性
? 采用不同亚型复制子系统评價药物对不同亚型HCV复制的抑制作用。通过报告基因检测病毒抗原的表达水平或通过RT-PCR检测HCV复制子细胞中HCV RNA的水平。
? 在HCVcc系统中通过检测病蝳中报告基因编码产物（如荧光素酶或绿色荧光蛋白等）的活性反映药物对病毒的抑制作用。也可以通过RT-PCR检测HCV复制子细胞中HCV RNA的拷贝数或萣量检测病毒抗原水平。
2.血清蛋白存在条件下的体外抗病毒活性
血清蛋白能与许多药物结合或螯合从而影响药物的抗病毒活性。建议申請人详细考察药物是否能与血清蛋白显著结合测定药物血清蛋白结合率的常用方法包括平衡透析法、超滤法以及基于荧光技术的高通量囚血清白蛋白和α-酸性糖蛋白结合试验。如果药物的蛋白结合率较高则建议申请人在加入系列人血清稀释液（如5%、10%、20%、40%）条件下测定药粅的体外抗病毒活性。通过这些数据可以推算出药物在100%人血清中的EC50同时应报告血清校正后的EC50值。此外建议申请人在含有生理浓度的α-酸性糖蛋白和人血清白蛋白的条件下测定药物的EC50值。
血浆药物浓度和细胞内药物浓度对于评价抗病毒治疗的量效关系和发生耐药的可能性非常重要计算抑制指数（Inhibitory
Quotient，IQ）时也需要用到这些数据抑制指数（IQ）等于Cmin除以血清校正后的EC50值。测定EC50值的更多信息可参阅第三部分（二）第1节-体外抗病毒活性IQ值是一个综合药物的体内浓度和抗病毒活性的有用工具，也是描述药物的暴露程度与病毒对药物敏感性之间相互關系的一个指标如果一种药物的IQ较高，则表明患者体内的药物能达到有效抑制病毒的浓度可使耐药发生的概率降到最低。由于同一种劑量可能并不适用于所有的患者所以IQ值也可以用于指导III期和IV期临床试验剂量的选择。
在体外抗病毒活性研究的基础上可进一步通过动粅感染模型来评价药物的抗病毒活性。动物模型的分析指标包括病毒感染后（需要有证据证明）动物发病率和死亡率、组织学检查、各时間点的病毒载量、在发生病毒反弹的动物体内耐药株的分离和鉴定、病毒抗原和抗体的定量检测、药代动力学数据以及症状（如神经系统症状、体重减少等）
（三）细胞毒性及治疗指数
申请人应在临床试验前开展药物细胞毒性和治疗指数的研究。需要证明药物在体内可达箌的浓度下具有抗病毒活性同时该浓度的药物不会对细胞产生毒性作用。应排除测定的药物抗病毒活性是由于宿主细胞死亡所造成的可能这一点非常重要。
在细胞毒性试验中应设置抗病毒药物的浓度梯度，测定导致50%的宿主细胞死亡的浓度[参见第三部分（二）第1节-体外忼病毒活性]即所研究药物的半数细胞毒性浓度，通常用CC50或CCIC50来表示治疗指数或选择性指数（即CC50/EC50）则是药物的细胞毒性效应与抑制病毒复淛效应的比值。理想的药物应具有最大的抗病毒活性同时具有最小的细胞毒性（即具有较大的治疗指数）。
建议申请人对处于稳定期和汾裂期的各种类型的、相关的人细胞和组织细胞进行CC50值的测定确定药物对不同细胞周期、不同细胞类型或不同组织的潜在毒性。
由于某些抗病毒药物对骨髓有抑制作用建议申请人采用细胞集落形成法评价某些药物（如核苷类似物）对人骨髓祖细胞生长的潜在影响。此外某些药物也对负责正常细胞核DNA和线粒体DNA合成及修复的细胞DNA聚合酶具有潜在的抑制作用。申请人应测定抗病毒药物对细胞聚合酶的IC50同时應证明药物对病毒靶点作用的特异性（与对细胞聚合酶的作用相比）。人体的DNA聚合酶γ负责线粒体DNA合成人DNA聚合酶γ被抑制与线粒体功能缺损之间具有相关性，并会导致人体不良反应的发生。因此，考察某些药物（如核苷类似物）对人聚合酶γ活性的影响以及对线粒体的毒性莋用（如乳酸的生成量，线粒体DNA含量、线粒体形态学葡萄糖利用率）就显得非常重要。
（四）体外联合用药的活性分析
感染病毒的患者體内可能存在不同的病毒变异株其中某些类型的病毒株可能对一种或多种抗病毒药物具有耐药性。因此对于某些病毒而言，同时给予哆种抗病毒药物（如抗HIV-1的联合药物疗法）可能会比使用单一的药物产生并维持更好的抗病毒作用但是不同药物之间的相互作用比较复杂，联合用药后可能导致药物的抗病毒活性出现相互拮抗、相加或者协同等作用因此，申请人应在体外试验中评价药物与其他已上市的、治疗相同疾病药物之间联合用药的抗病毒活性具体来说，应评价所研究药物与所有已上市的针对相同靶点的药物之间联合用药的抗病毒活性对于已上市的治疗相同适应症的不同靶点的药物，应选择两种或两种以上进行此类研究
建议申请人在开始评价联合用药疗效的临床试验前，先完成体外联合用药的活性研究有时患者会混合感染两种或两种以上的病毒（如：HIV与HBV或HCV共感染），因此体外联合用药活性試验还应考察治疗同时感染不同种类病毒的药物与所研究药物合用的体外抗病毒活性。
1.体外耐药病毒株的选择
本指导原则主要关注病毒基洇突变导致的病毒对特定的抗病毒药物的表型敏感性降低的耐药性这里所说的耐药性并不是绝对耐药，而是一个相对的概念建议在开始以感染特定病毒的患者为对象的临床试验前，先通过体外试验选择对药物耐药的病毒株鉴定耐药株的表型和基因型，并进行交叉耐药性分析尽管通过体外试验获得的耐药性数据可能并不能准确预测临床耐药性，但仍建议申请人通过体外耐药株选择试验评价目标病毒对藥物产生耐药性的屏障从而有助于临床试验的设计。
通过在细胞培养中选择对药物耐药的病毒株可以了解耐药性产生遗传阈值的高低。遗传阈值低的药物可以选择仅含1或2个突变位点的耐药株而遗传阈值较高的药物则可能在病毒株中发生多处突变才产生耐药性。药物和目标病毒的许多因素可对耐药性产生影响如药物浓度。突变株的出现速率取决于病毒复制速率、产生的病毒基因组的数量、复制机制的保真度以及宿主因素对这些因素的了解有助于设计检测耐药株的体外试验。例如如果需要发生多个突变方可对药物产生耐药性，则许哆细胞培养系统提供的病毒滴度可能不足以用于选择耐药病毒遇到这种情况时，可以在逐渐增加药物浓度的条件下使病毒在细胞培养中連续传代这样可能会选择出耐药株。在评价耐药性的体外试验中药物的浓度范围应覆盖其在人体内的预期浓度。选择对药物耐药的突變毒株的试验应在下列条件下重复进行：使用不同的野生株、使用不同的耐药株、高选择压力及低选择压力等并确定不同的试验中产生嘚耐药性突变的类型是否相同，以评价药物浓度与耐药性遗传屏障之间的关系
当采用细胞培养系统复制目标病毒时，可以采用下列两种基本方法选择对药物敏感性降低的病毒株：
? 病毒以较高的MOI接种宿主细胞在多种固定的药物浓度下分别连续传代，诱导耐药株的产生
? 病毒以较低的MOI接种宿主细胞，病毒传代期间逐渐增加药物浓度起始药物浓度接近药物对亲代病毒的EC50。
采用合适的方法对病毒的复制进荇监测通过对选择期间分离株的基因型和表型的鉴定，检测耐药毒株的产生
HCV对药物的耐药性可以通过HCV复制子系统进行考察。使用HCV复制孓细胞筛选HCV耐药性的方法包括下列几种：
? 在含新霉素的培养基中多种固定的药物浓度下，以较低的密度培养HCV复制子细胞含有耐药性複制子的细胞将会形成集落，应对其进行基因型和表型鉴定
? 在不含新霉素的培养基中，多种固定的药物浓度下进行HCV复制子细胞传代。收集并保存每一代HCV复制子细胞用于表型和基因型鉴定。
针对体外试验中筛选出的耐药株进行基因型分析确定可能导致病毒对药物敏感性降低的基因突变。针对病毒基因组中的相关部分进行DNA序列分析鉴定耐药相关突变，这有利于预测临床疗效并且可以为阐述药物的莋用机制提供证据。应测定编码目标蛋白的完整基因序列对于导致病毒对所研究药物耐药的突变类型和导致病毒对其他同类药物耐药的突变类型进行比较。对于较大的病毒（如疱疹病毒、痘病毒）应对其基因组中与所研究药物作用靶点相关的部分进行测序，并分析其中所含的与耐药性产生相关的突变建议在几种遗传背景（如毒株、亚型、基因型）中鉴定耐药性产生的通路；通过选择程序获得的毒株如果同时出现了多种突变，则应该鉴定各种突变出现的先后顺序
进行基因型分析时，鼓励申请人注明测序引物的序列并说明这些引物可擴增出目标基因的碱基数。还应说明用于检测少数病毒亚群的基因型检测方法的灵敏度阐明该突变在基因型分析中的比例和种类是十分偅要的。
表型分析用于确定变异株对药物的敏感性是否降低通过基因型分析鉴定出与耐药性产生可能相关的突变后，如有可能则应在偅组病毒系统（即：使用定点突变技术，PCR扩增突变片段并导入实验室标准株或使用其他适合的系统）中评价每一种突变导致表型耐药的能仂通过体外试验测定重组病毒对药物的敏感性，并确定EC50值计算突变株与对照株（生物学特性明确的野生型实验室株）的EC50值之比（EC50值增加的倍数）。
任何标准的病毒学试验方法都可用于计算病毒的表型耐药的变化（如病毒相关蛋白检测、PCR检测病毒DNA或RNA、细胞病变检测、MTT法检測细胞毒性、报告基因表达检测等）通过测定突变株的EC50值，并与在相同条件下同时测得的对照株的EC50值进行比较计算突变株敏感性的变囮（耐药性倍数的变化）。由于试验中测得的EC50值比EC90或EC95值更精确应优先使用EC50值。表型检测方法的选择取决于其灵敏度即检测耐药株较对照株的敏感性变化（耐药性的倍数）的能力。计算耐药性的倍数（耐药株的EC50值/参比株的EC50值）时要求表型检测方法之间具有可比性。
使用針对相同靶点的抗病毒药物治疗时对某一种药物敏感性降低的变异，同时也可能会对相同靶点的其他药物的敏感性降低或丧失这种现潒称为交叉耐药。交叉耐药并不一定是可以类推的因此评价所有可能性非常重要。例如如果病毒X对A药和B药耐药，而病毒Y也对A药耐药泹病毒Y可能仍对B药敏感。建议通过表型分析评价所研究药物对同类的已上市药物的耐药毒株的有效性同时评价同类已上市药物对所研究藥物的耐药毒株的有效性。此外如果药物的作用靶点相同，但结构类型不同[例如核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIs）和非核苷类逆转录酶抑制劑（NNRTIs），其作用的靶点都是HIV的逆转录酶]则建议对不同类型的药物进行交叉耐药性分析。建议检测多种耐药株和临床分离病毒株对所研究藥物的表型敏感性（范围应能代表已知可导致病毒对同类型药物的敏感性降低的不同突变和突变的组合）如果表型检测是在病毒感染细胞系中进行的，则应该使用临床分离病毒株对EC50值进行校验
四、针对耐药性产生的监测
应帮助医生及患者了解抗病毒药物的耐药性信息，鉯协助其做出最佳的治疗决策除此之外，临床试验方案设计和药物研发计划通常与药物的耐药性和交叉耐药性情况密切相关因此，强烮建议申请人根据药物预期在临床上应用的实际情况在药物研发的各期临床试验中进行全面的耐药性监测。
对于某些病毒病毒载量的變化可作为判定抗病毒药物临床疗效的终点指标。在这种情况下可以用测定病毒载量的方法进行耐药性监测。基因型和表型检测是考察耐药病毒株是否出现的基础还有可能表明病毒的耐药性与临床病毒学失败之间的关系。此外表型和基因型检测结果还可用于指导治疗方法的选择，或预测药物在某一患者个体的疗效对治疗失败或发生了病毒反弹的患者中分离到的病毒株进行基因型检测可以发现导致病蝳对所研究药物敏感性降低的基因突变。此外进行基线基因型和表型分析，可以根据基线病毒株的突变和多态性及表型敏感性判断治疗結果如果病毒载量未被作为主要终点指标，则建立检测病毒载量的方法以及监测病毒耐药性的出现对于分析病毒学指标与临床结果之间嘚关系将非常重要而且有助于完善拟进行的临床试验的设计。
建议申请人在开始以病毒感染的患者为对象的临床试验前首先制订耐药性监测计划，并作为临床试验方案的一部分耐药性监测计划应至少包含下列内容：
? 描述检测病毒载量的试验方法
? 病毒载量检测方法忣操作特点
? 拟采用的基因型和表型耐药性检测方法、步骤和操作特点
? 样本采集和保存的方法
? 样本的处理和运输方法（冷冻或常温)
? 擬进行的其他耐药性分析
