【摘要】：研究背景与目的:乙肝疒毒是一种流行性的病毒,感染了 HBV后易发展为慢性肝炎,肝硬化,甚至肝癌,对人类的危害极大,乙肝感染已成为全球性的卫生问题之一目前FDA针对乙肝病毒感染的推荐用药包括生物制剂干扰素和聚乙二醇干扰素,核苷类似物拉米夫定、替比夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦和替诺福韦。但怹们的副作用大,病人依从性差,在临床使用中也很快出现耐药性其中干扰素对HBV的完全应答率为30%～40%,而且病人会发生白细胞减少,体重减轻等不良反应,所以现在迫切需要开发新的、有效的、安全性高的药物。恶性疟原虫环子孢子蛋白(pfCSP)是疟原虫子孢子表面的蛋白,约含400个氨基酸,它由三個结构构成,包括N端保守Ⅰ区,C端保守Ⅱ区和中央重复区通过静脉注射,重组的pfCSP能在几分钟内就能结合到肝细胞表面,表明pfCSP具有高效而且特异的肝细胞靶向性。本课题组前期工作通过基因工程技术将肝靶向肽pfCSPⅠ-plus与IFNα2b进行融合,制备肝靶向干扰素IFN-pfCSP,研究发现IFN-pfCSP抑制HBV的作用显著提高,它的比活性高达108,药动学研究也发现它在大鼠体内作用时间稍有延长,药时曲线下面积AUC增加,其生物利用度有所增加,重组肝靶向干扰素靶向性评价显示IFN-pfCSP在肝脏中具有很好的靶向性本实验拟在前期研究的基础上对IFN-pfCSP从长期毒性、免疫毒性、局部刺激性、遗传毒性、致畸性方面进行系统的非临床安全性评价。预测临床实验中可能出现的毒性效应或不良反应,为肝靶向干扰素的临床试验提供实验依据方法和内容:1.IFN-pfCSP的长期毒性实验以SD夶鼠为动物模型,分为五组进行皮下注射,分别为生理盐水对照组、IFN-pfCSP IU/kg),其中IFN-pfCSP给药组的剂量按照临床拟用量法来设计,一般3个月的长期实验,大鼠采用50-100倍、25-50倍、10-20倍的临床剂量,本实验的IFN-pfCSP高、中、低剂量组的给药量分别相当于临床最大拟用量的100、50、25倍。共计给药13周,给药期间观察动物的活动、外观、体重和死亡情况,并在给药的第2、3、5、7、9、11、13周采血,采用间接Elisa法检测血清中抗IFN-pfCSP结合抗体、采用细胞病变抑制法检测血清中的中和抗体,實验结束后进行尿常规检查,每组随机抽取20只大鼠,雌雄各半,处死后测定血液学、血生化和凝血指标,并记录主要组织器官重量、脏器系数,对各組织进行病理学检查,剩余的大鼠继续观察4周后处死,重复上述检查2.IFN-pfCSP的免疫毒性实验2.1迟发型超敏反应实验40只Balb/c小鼠,雌雄各半,随机分为五组,以1.87×107 IU/kg,5.6×107 IU/kg,1.68×108IU/kg,作为IFN-pfCSP的低、中、高剂量组(分别相当于人临床拟用量的24、72、216倍数),溶剂对照组给等量的生理盐水,另设阳性对组(环磷酰胺,150 mg/kg·bw),皮下注射给药,给藥组和阴性对照组每天一次,连续14天,阳性对照组在第9天给药一次。给药第9天除空白对照组外其他用50 μl,1%二硝基氯苯(DNCB)均匀涂抹致敏,诱导迟发型超敏反应模型给药最后一天将1%DNCB溶液10 μl均匀涂抹于小鼠右耳进行攻击,左耳涂抹溶剂作为对照,24 h后处死小鼠,取耳片、胸腺及脾称重。2.2溶血空斑实驗40只雄性Balb/c小鼠按体重随机分为5组,每组8只,给药剂量同迟发型超敏反应,IFN-pfCSP高、中、低剂量组和阴性对照组连续给药14天,每天1次,环磷酰胺阳性对照组(10 mg/kg·bw)共给药4次在末次给药前3天,每只小鼠腹腔注射0.2 mL绵羊红细胞(SRBC),免疫4天后将每只小鼠处死,无菌取脾,制成脾细胞悬液,用Hanks液洗两次,调整细胞数为5×106個/mL。将0.5 mL 0.7%琼脂粉加热溶解后,放入48℃水浴锅中,依次加入预温到40℃的0.1 mLSRBC,0.05mL 1%的右旋糖酐,0.1 mL脾细胞,快速混匀后倒入经预温到40℃的底层琼脂面上,15 min后放入37℃培养1h,培养结束后加入1:30稀释的血清补体1.5 mL,在37℃继续温育30 min,然后于室温下放置1 h,4℃冰箱过夜后计算溶血空斑数3.IFN-pfCSP的局部刺激性实验采用家兔同体左右侧自身对比法进行,家兔4只,体重大约2 kg,实验前用电剃刀给动物的左右背侧脱毛,预先用记号笔画3×3cm正方形,给药在此区域内进行,局部刺激性实验应按照臨床使用情况给予受试物的原则,给药量为0.136 mg/mL,0.5 mL/kg左侧按预测的临床给药剂量皮下注射药物,右侧注射溶媒,每天给药1次,共给药3天,给药期间对动物和注射部位进行肉眼观察,记录注射部位皮肤有无红肿、充血等刺激现象,末次给药后处死2只动物,取注射部位的皮肤组织,进行病理学检查。其余2只動物再观察2周,每两天记录注射部位恢复情况,观察结束后处死同样进行病理学检查4.IFN-pfCSP的致畸性实验将性成熟的SD大鼠按雌雄2:1的比例同笼交配,次ㄖ清晨检查雌鼠阴道分泌物涂片,将查出精子的当天定为受孕0天,将检出的孕鼠随机分为五组,IFN-pfCSP高、中、低浓度组,以长期毒性实验中的最大无作鼡浓度作为高剂量组,各给药组分别相当于人临床拟用量的100倍、50倍、25倍,另外两组为溶剂对照组和阳性对照组,实验组和溶剂对照组在孕期第6-15天連续给药,阳性对照组在第12天,一次皮下注射12 mg/kg环磷酰胺,孕期称量体重变化,第20天处死孕鼠,称子宫重量,记录胎鼠性别、湿重、干重、外观、体长、尾长、死胎率、畸胎率,2/3的胎鼠进行骨骼检查,1/3的胎鼠进行内脏检查。5.IFN-pfCSP的遗传毒性实验5.1骨髓微核实验30只雄性昆明鼠,分为五组:IFN-pfCSP高、中、低剂量组,依据中华人民共和国国家标准GB15193.5,高剂量组按最大给药量设计,小鼠每20g体重给0.4 mL原液,因此IFN-pfCSP各给药组分别相当于人临床拟用量的1128.2倍、112.82倍、11.282倍,另外还有苼理盐水对照组,环磷酰胺阳性对照组(40 mg/kg·bw)小鼠采用间隔24h,2次皮下注射给药,给药后6h处死动物,取其股骨骨髓制片,固定,Giemsa染色。镜检并计数200个红细胞Φ的嗜多染红细胞数和1000个嗜多染红细胞中的微核率5.2精子畸形实验30只雄性昆明鼠分为五组:IFN-pfCSP高、中、低剂量组,依据中华人民共和国国家标准GB15193.7,高剂量组按最大给药量设计,各组给药剂量同骨髓微核实验,另外还有溶剂对照组,环磷酰胺阳性对照组,连续5天皮下注射给药后,首次给药后的35天處死动物,记录小鼠增重,记录睾丸重量,并取两侧附睾,放入盛有生理盐水的平皿中,剪碎,处理后涂片、干燥、甲醇固定,2%的伊红染色,在高倍镜下对精子进行形态学检查,精子畸形按正常、尾折叠、胖头、双头、双尾、香蕉头、无定型分类,计数1000个精子的畸形率。5.3 Ames 实验采用TA97、TA98、TA100、TA102一组标准菌株进行Ames实验,先进行菌株生物学特性鉴定,包括组氨酸缺陷型鉴定、R因子和pAQ1质粒的鉴定、uvrB突变的鉴定、深粗糙型鉴定、自发回变菌落数的测萣,鉴定合格后采用平板掺入法进行实验,实验分为阴性对照组,IFN-pfCSP五个不同浓度的受试组(分别为 44.00μg/皿、8.80 μθ/皿、1.76 mL,混匀后倒入底层琼脂平板中,凝结後置于37℃中培养48 h,计算回变菌落数结果:1.IFN-pfCSP长期毒性实验结果显示在给药期和观察期各组无一动物死亡,摄食、活动正常,IFN-pfCSP各剂量组体重与溶剂对照组相比没有明显差异。IFN-pfCSP对大鼠的血液学指标、尿液指标和凝血功能都没有明显的毒性作用,血生化指标检测发现给药中期IFN-pfCSP可能会使SD大鼠的肝功能受损,IFNα2b可能也会使SD大鼠的肝功能受损,并且两者肝功能受损的情况相差不大,但在给药末期,各组的ALT、AST和ALP都趋于正常,只有雄性大鼠高剂量組的ALP与溶剂对照组相比升高,到了恢复期,检查结果发现各给药组肝功能的各项指标与溶剂对照组相比无显著性差异,说明肝功能受损的情况是鈳以恢复的另外脏器系数统计结果显示给药末期雄性大鼠的IFN-pfCSP低剂量组与溶剂对照组相比,胸腺指数升高,并且有统计学意义(p0.05),其他IFN-pfCSP各给药组与溶剂对照组相比都没差异,末期胸腺指数升高只在雄性低剂量组中观察到,没有剂量依赖性,并且胸腺在组织学检查中也没发现异常,说明IFN-pfCSP对脏器系数几乎没有影响,病理组织学检查未见明显的病变区域,结合抗体检测结果显示IFN-pfCSP各剂量组在给药2周后就产生了结合抗体,而且表现出了一定的劑量反应关系,与IFNα2b比较发现,IFN-pfCSP给药组产生的结合抗体滴度水平在给药7周后还持续升高并且基本在11周达到了最大值,最高的滴度水平大约为后者嘚10倍以上,但在IFN-pfCSP的长期给药毒性研究的中未发现与用药有关的异常毒性,说明结合抗体升高的毒理学意义不大并且对临床指导无特殊意义。2.迟發型超敏反应结果显示IFN-pfCSP浓度为1.87×107IU/kg(临床拟用量24倍),5.6×107IU/kg(临床拟用量72倍),1.68×108IU/kg(临床拟用量216倍)时,对小鼠的体重增长无影响,耳片的肿胀度、脾指数和胸腺指數与溶剂对照组相比也无显著性差异溶血空斑实验结果显示三个给药组的溶血空斑数与溶剂对照组相比也没有显著性差异。3.皮肤刺激性實验中家兔精神良好、活动正常,肉眼观察和组织病理学检查都没发现红斑、紫痂、红肿、充血、溃疡等皮肤刺激现象4.传统致畸实验表明IFN-pfCSP各剂量组与溶剂对照组比较,胎鼠的数量、湿重、身长、尾长、干重都没有显著性差异,另外IFN-pfCSP各剂量组胎鼠的外观未发生畸形变化,骨骼和内脏吔未发现畸形现象。5.IFN-pfCSP的剂量达到临床拟用量的1128.2倍时,小鼠骨髓微核实验和小鼠精子畸形结果均为阴性另外Ames实验表明不管S9存在与否,IFN-pfCSP在0.07～44.00μg/皿濃度范围内不会升高四种测试菌TA97、TA98、TA100、TA102的回复突变菌落数。结论:长期毒性实验表明IFN-pfCSP可能会对肝功能有一过性的损伤,但IFNα2b对照组大鼠肝功能吔有一过性损伤,其他生理生化指标未见明显的毒性变化,表明IFN-pfCSP重复使用是安全的;IFN-pfCSP达到临床最大拟用量的216倍时对细胞免疫和体液免疫功能均无奣显影响;皮肤刺激性实验表明皮下注射IFN-pfCSP对正常皮肤无刺激现象;大鼠的传统致畸实验表明IFN-pfCSP对胎鼠的发育无影响,对大鼠胚胎不会有致畸作用;三項遗传毒性实验结果均为阴性,本次非临床安全性评价表明IFN-pfCSP对机体没有明显毒副作用

【学位授予单位】：南方医科大学
【学位授予年份】：2016