主堡痘理堂盘查垫！！堡！！旦筮！！鲞箜！！塑鱼垡！』堕尘虫堡竺！里！塑；！！！：ｙ！！：！！盟！：！！

ＲＮＡ干扰Ｅｚｒｉｎ蛋白表达对胰腺癌细胞系

Ｐａｎｅ一１细胞生物学行为的影响

目的探讨ＲＮＡ干扰Ｅｚｒｉｎ对胰腺癌胞系Ｐａｎｅ＋１细胞生物学行为的影响。方法建

立靶向Ｅｚｒｉｎ干扰质粒稳定转染Ｐａｎｅ一１细胞，并用流式细胞术检测细胞周期ＣＣＫ．８法检测细胞增

殖情况，扫描电镜观察细胞表丽形态及表面突起的变化软琼脂克隆形成实验检测细胞体外非锚着依

赖性的生长能力，用未包被及包被Ｍａｔｒｉｇｅｌ胶的Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室分别检测细胞的运动和侵袭能力

结果ＲＮＡ干扰Ｅｚｆｉｎ后其蛋白的表达明显下降，Ｐａｎｅ．１表面的细胞突起、微絨毛数量明显减少体

外非锚着依赖性的生长能力也明显下降，运动及侵袭能力也明显下降但对细胞的体外增殖和细胞周

期没有明显的影响。结论Ｅｚｒｉｎ蛋白的表达对胰腺癌细胞的细胞突起、表面微绒毛的形成、细胞骨

架及非锚着依赖性的生长发挥着重要的作用干擾Ｅｚｆｉｎ的表达将对胰腺癌细胞的表面突起的形成、

细胞骨架以至细胞运动及在转移灶的存活中起着重要的作用。

【关键词】胰腺肿瘤；细胞骨架；肿瘤细胞培养的

ＭＥＮＧ地ｎ—ｘｉａｏ．ＹＵ

Ｓｈｕａｎｇ—ｎｉ．￡Ｕ

Ｚｈａｏ—ｈｕｉ，ＣＨＥＮ

Ｊｉｅ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ

ＰａｔｈｏｌｏｇｙＰｅｋｉｎｇ

Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｈｉｎｅｓｅ

ＳｃｉｅｎｃｅｓＰｅｋｉｎｇ

Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅ柳ｎｇ

１００７３０Ｃｈｉｎａ

Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ

ａｕｔｈｏｒ：ＣＨＥＮ

Ｊｉｃ，Ｅ—ｍａｉｆ：ｘｈｂｌｋ＠１６３．ｃｏｒｎ

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ

Ｐａｎｅ一１．Ｍｅｔｈｏｄｓ

ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ

ｐｌａｓｍｉｄ．Ｔｈｅ

ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ

ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ

ｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎｓ／ｍｉｃｒｏｖｉｌｌｉ

ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｃｏｌｏｎｙ

ａｎｃｈｏｒ．ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ

ｖｉｔｒｏ．Ｔｒａｎｓ．ｆｉｌｔｅｒ

ｗｉｔｌｌ／ｗｉｔｈｏｕｔ

ｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎｓ／ｍｉｃｒｏｖｉｌｌｉ

ｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｃｈｏｒａｇｅ—ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ

ｇｒｏｗｔｈ，ｃｅｌｌ

ｉｎｖａｓｉｏｎｂｕｔ

ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ

Ｐａｎｅ．１．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ

ｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎｓ／ｍｉｃｒｏｖｉｌｌｉ

ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ａｎｃｈｏｒａｇｅ—ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ

ｇｒｏｗｔｈｃｅｌｌ

ｗｏｒｄｓ】Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ

Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ；Ｔｕｍｏｒ

ｃｅｌｌ，ｃｕｌｔｕｒｅｄ

Ｅｚｒｉｎ为一种胞质内的细胞骨架蛋皛属于

ＥＲＭ（Ｅｚｒｉｎ．ｒａｄｉｘｉｎ—ｍｏｅｓｉｎ）家族，由Ｖｉｌ２基因编码

在细胞骨架和细胞膜之间起连接作用¨Ｊ，参与细胞

形态改变、细胞膜结构组建、细胞运动、黏附及相关

信号转导，在肿瘤细胞运动、黏附、侵袭中发挥重要

作用心ｊ胰腺癌细胞极强的侵袭和转移能力与患

ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０５２９－５８０７．２０１２．１２，００９

基金项目：国家自然科学基金（３０４７１９７０）；国家科技支撑计划

（２００６ＢＡｌ０２Ａ１４）；卫生行业科研专项课题（２００８０２０１１）

作者单位：１００７３０中国医学科学院北京协和医学院北京协和

通信作者：陈杰Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｈｂｌｋ＠１６３．ｃｏｎ

者预后差直接相关。有学者发现Ｅｚｒｉｎ的高表达可

以促进多种肿瘤的转移∞Ｊ可能是某些肿瘤基因治

疗的潜在靶点。越来越多嘚研究表明Ｅｚｒｉｎ在肿瘤

细胞的生物学行为中发挥着重要的作用［３－７］ＲＮＡ

ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）是同源性双链ＲＮＡ

ＲＮＡ）介导的转录后基因

沉默（ｐｏｓｔ—ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ

ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）能够特异

高效的降解靶基因的ｍＲＮＡ，因而在抗肿瘤治疗方

面显示了巨大的潜力和良好的应用前景我们旨在

利用ＲＮＡｉ技术对胰腺癌细胞系Ｐａｎｅ．１细胞中

Ｅｚｒｉｎ的表达进行干预，进而探讨Ｅｚｒｉｎ对胰腺癌生

！ｉ！垡瘟理芏苤查垫！！生！！』！筮兰！鳖笙！！塑鱼丛！』！塑型：！！！！！：！！坠！垫！！：！塑：兰！！∑：！！

１．材料：人胰腺癌Ｐａｎ（?一１、ＭＩＡ

ＰａＣａ．２、ＡｓＰＣ．１、

ＢｘＰＣ一３细胞系Ｆｆｌ美同标准仨物品保存巾心

ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）提供胰腺

细胞系Ｐｃ—ｌ、ＰＣ－２、ＰＣ一３、ＰＣ－４、ＰＣ－７为我室Ｉ，Ｉ建

２．１一Ｕ６载体为中国医学科学院医学基础

研究所张强博士惠赠Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室购自美旧

Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ公ｆｊＪ。兔抗人多克隆抗体Ｅｚｒｉｎ购

自Ｕｐｓｔａｔｅ公司．鼠抗人单克隆抗体ＧＡＰＤＨ购Ｊｉ

Ｃｒｕｚ公司。ＨＲＰ标记的山羊抗兔、山羊抗小

鼠ＩｇＧ购自北京巾杉金桥生物技术有限公司二

２．Ｅｚｒｉｎ—ｒ扰序列的设計、化学合成及载体的

构建：利用Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ网站提供的设汁ｔ具根据

ｓｈＲＮＡ的设计原则设计两对特异性抑制Ｅｚｒｉｎ嘚序

５’．（；ＧＧＣＣＡＡＧＵＵＣＵＡＣＣＣＵＧＡＡＧ．３’．

Ｌ－ＵＵＣＣＵＵＧＧＡＧ

一对编码核苷酸的序列打乱顺序后的序列（№．３：

５’－ＧＡＵＣＣＧＡＣＵＣＣＧＡＡＧＵＣＡＧＣＵ一３

列经序列比对未发现该序列与任何已知基闪同源．．

化学合成仩述序列的ｓｈＲＮＡ后，经Ｉ二扰胰腺癌细胞

系Ｅｚｒｉｎ蛋白表达验证其有效性后将有效序列及

对照序列导入真核表达载体ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ

将有效序列及其互补序列中间加一个９个碱基的

环，分别合成后插入到载体ｐＳｉｌｅｍ?ｅｒ

ＩＩＩ酶切位点之间；同样嘚方法建

立对照载体；通过测序验证插入序列的正确性

３．细胞培养、转染及稳定转染细胞系的建立：

胰腺癌细胞系以含１０％胎牛Ｉ缸清ＤＭＥＭ培养液培

养，置于３７℃含５％ＣＯ温箱巾。细胞以５

１０５／：ｆＬ的密度种植于六孔板巾所有的转染均ＪＨ

ｌｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ

２０００介导，转染后２４

ｍｇ／Ｌ）加入培养液中用于稳定转染细胞系的

建‘萨每２—３天换液一次，约２—３周後稳定转染

Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ一８）法测定细胞乍长

曲线：细胞以ｌ×１０’每孔种植Ｆ

２１个孑Ｌ设３个平行孑Ｌ。每组每天分别測３孔每孔

加入ＣＣＫ．８试剂１０

ｈ后检测４５０ ｎｍ的吸光度

（Ａ）值，参比波长为６３０

５．检测细胞周期：不同分组细胞培养４８

酶消化收集细胞；以７０％乙醇吲定过夜：ｌ％１１Ｉ．ｉｔｏｎ

Ｘ一１００（Ｖ／Ｖ）５斗ｌ１

加碘化丙啶（溶解于ＰＢＳ，终濃度为５０

ｎｆｉｎ．收获的细胞密度不低于ｌ

ｎｍ测量细胞ＤＮＡ含量：

６．软琼脂克隆形成实验：超净［作台混合配置

上层及下层琼脂培养液：下层培养液含有０．５％软

琼脂＋ｌ×ＤＭＥＭ培养液＋１０％胎牛ｍ清；ｔ－．层培

养液含有０３５％软琼脂＋ｌ×ＤＭＥＭ培养液＋１０％

胎牛ｍ清；首先铺下层软琼脂培养液．向２４孔板每

ｍＩ底层琼脂，静置凝周将上层软琼脂

培养液分装至离心管ｒｆＩ每管１．５

细胞，混匀后平均加入３孑Ｌ铺有下层软琼脂的２４孔

ｏＣ５％ＣＯ！培养箱培养３周；倒置显微镜

下汁算每孑Ｌ的克隆数和克隆形成碍《。

７．扫描电镜：细胞以５

ｈ后以ＰＢＳ洗；２．５％戊二醛同定室温

ｒａｉｎ左右；ＰＢＳ洗；ｌ％ＯｓＯ．后凅定ｌ～２

梯度乙醇或丙酮脱水；临界点ｆ燥或冷冻干燥；喷镀

碳与金；扫描电镜观察，照相

８．细胞迁移和侵袭能力分析：细胞迁移通過具

有聚碳酸酯微孔滤膜（孑Ｌ径８“ｍ）的Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室

１０４个细胞．ｊ目无ｍ清ＤＭＥＭ

培养液重悬下室内置５００

ｔｔｌ含有１０％ｌｉｌｔ清的

ＤＭＥＭ作为化学趋化物。对细胞侵袭能力分析ｊＨ

Ｍａｔｒｉｇｅｌ包被的侵袭小室分别培养１２或２４

用棉拭子去除上室底部基质胶并移除未穿透细胞，

而迁移和侵袭的细胞经过Ｉ司定后以结晶紫染色．选

择５个２００倍湿微视野统计總细胞数以迁移细胞

的相对数目表示肿瘤细胞的迁移能力；每组设３个

平行样本，取其平均值行统计学分析．

９．统计学方法：每种實验至少重复３次：

所有数据以ｉ±ｓ表示，两样本问均数的比较用独晓

样本ｔ检验，同一组不同处理均数比较用配对资料

检验。数据處理应片Ｊ

Ｐ＜０．０５表示差异有统汁学意义：

ｂｌｏｔ检测９株胰腺癌细胞系Ｅｚｒｉｎ表

达情况：取９株胰腺细胞系ＰＣ—ｌ、Ｉ）Ｃ．２、ＰＣ－３、ＰＣ－４、

ＰＣ－７、Ｐａｎｅ—ｌ、ＢｘＰＣ一３、ＡｓＰＣ－ｌ、ＭＩＡ

蛋白（２０“ｇ／孔）．』Ｈ扰Ｅｚｒｉｎ的多克隆抗体进行

ｂｏｈ检测并以ＧＡＰＤＨ作为内参照，Ｅｚｒｉｎ

存９种胰腺癌细胞系ｒｆｌ均呈较强表达（图１）

２．〣化学合成法验诅：干扰位点的有效性：分刖

将化。浮合成的小ＲＮＡ（ＮＯ．１和ＮＯ．２）及对照小

ＲＮＡ（Ｎ（）．３）ＪＩ

Ｌｉｐｏｆｅｅｔａｍｉｎｅ

２０００转染胰腺癌细胞

ｌ＇．＇ｚｒｉｎ■—●●—●●—●■—■●＿●－＿＿■一●—■

ＧＡＩ＂ＤＩｌ’－●一●———－●●－●－●－－＿ｉｍｍ．ｍ－－

ｌ：ＰＣ．１２：ＰＣ?２，３：ＰＣ－３４：ＰＣ４，５：ＰＣ－＇／６：Ｐａｎｅ－ｌ，７：ＢｘＰＣ?

３．８：ＡｓＰＣ－ｌ９：ｂｌｌＡ

Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测９株胰腺癌细胞系Ｅｚｒｉｎ表達情况

系Ｐａｎｅ．１细胞，７２

Ｅｚｒｉｎ表达的改变发现Ｎｏ．２化学合成的小ＲＮＡ干

扰效果最优（图２），遂将根据其序列构建的干扰载

体用于后续的干扰试验

１ｍ１●～＿洲“一。一

ＣＡｔ，Ｉ）ｔｔ●—●＿●◆ＧＡ｝’ＤＨ■—■—■—◆●—一Ｉ

ｂｌｏｔ检测化学合成的小干扰ＲＮＡ千扰位点的有

效性（Ｍ：标志物ｌ：小ＲＮＡ

Ｎｏ．１．２：小ＲＮＡ

Ｎｏ．２，３：小ＲＮＡ

ｂｌｏｔ检测Ｅｚｒｉｎ稳定干扰细胞系的有效性

（１：Ｐａｎｅｚｓｉ．ｓｃ硼２：Ｐａｎｅｚｓｉ－２．３：Ｐａｎｅｚｓｉ－９）

３．Ｅｚｒｉｎ稳定干扰细胞系的建立：采用干扰效应

最强的Ｎｏ．２靶序列及对照Ｎｏ．３序列构建干扰载

体ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．１．Ｕ６

Ｎｏ．２质粒和对照ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．Ｉ—

Ｎｏ．３质粒，分别转染Ｐａｎｅ—ｌ细胞并用Ｇ４１８筛

选Ｃ，４１８筛選的细胞克隆的效果通过免疫印迹来

评定获得稳定转染细胞系Ｐａｎ

ｅｚｓｉ－ｓｃｒｌｔｍ（对照）、

ｅｚｓｉ－９。免疫印迹皆显礻相对于ｘ：ｔＮ

细胞，稳定转染细胞系Ｐａｎ

ｅｚｓｉ－９的Ｅｚｒｉｎ

表达明显下降经光密度分析显示，Ｐａｎ

ｅｚｓｉ－９的Ｅｚｒｉｎ表达分别下降了４８．７％及９６．７％而

ｅｚｓｉ－９的Ｅｚｒｉｎ蛋白表达下降更明显，因此将该

克隆用于后续的实验（图３）

４．Ｅｚｒｉｎ敲减表达对细胞增殖的影响：用ＣＣＫ－８

ｅｚｓｉ．ＳＣｌ＇ｌｌｍ和Ｐａｎ

ｅｚｓｉ－９细胞的增殖能

力，发现Ｅｚｒｉｎ表达下调后对细胞的增殖能力没有

５．Ｅｚｒｉｎ敲减表达对细胞周期的影响：流式细胞

术检测细胞周期发现Ｐａｎ

ｅｚｓｉ－９的Ｇ。期细胞比例

ｅｚｓｉ一８ｃｒｌｔｍ为６５．１％它们之间的差

异没无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。Ｐａｎ

ｅｚｓｉ－９的Ｇ２／Ｍ

期细胞比例为１９．７％Ｐａｎ

ｅｚｓｉ－ｓｃｒａｍ为２３．０％，差

异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）ｓ期細胞比例，Ｐａｎ

ｅｚｓｉ－９为１５．４％对照细胞为１１．８％，差异无统计

学意义（Ｐ＝０．０６）数据分析表明，Ｅｚｒｉｎ的表达敲

减对细胞周期没有明显的影响

６．软琼脂克隆形成率分析：Ｐａｎ

ｅｚｓｉ－ｓｃｒａｍ细胞

ｅｚｓｉ－９细胞，分别培养３周后发现Ｐａｎ

￥ｅｒａｍ细胞克隆形成率为（１０．５±０．８）％，Ｐａｎ

９克隆形成率为（４．８±０．９）％，两者的差异有统计

学意义（Ｐ＝Ｏ．００８３）Ｅｚｒｉｎ表达下调后细胞克隆形

成率降低了５４．３％。

ＣＣＫ－８法测定Ｅｚｒｉｎ敲减表达对細胞增殖的影响

７．形态学改变：为探讨Ｅｚｒｉｎ敲减表达是否参

与了细胞骨架的重构用扫描电镜观察Ｅｚｒｉｎ表达

下调的稳转细胞形态的改变。相对于对照细胞稳

ｅｚｓｉ－９的细胞突起和微绒毛明显

减少，而对照细胞Ｐａｎ

ｅｚｓｉ．ｓｅｒｌｌｍ的细胞突起囷微绒

毛较多且更长（图５）

８．细胞迁移和侵袭能力分析（图６）：细胞迁移

能力实验显示迁移到下层小室的Ｐａｎ

ｅｚｓｉ－９（圖６Ｂ）

的细胞数量是（１１．３．４－４．２）／ＨＰＦ，而对照Ｐａｎ

８ｃｒａｍ细胞（图６Ａ）为（１２４．３±２１．３）／ＨＰＦ。定量分

析表明Ｅｚｒｉｎ敲减表达后迁移到下室的细胞减少了

９１．Ｉ％（Ｐ＝０．００００３）细胞侵袭实验显示Ｐａｎｅｚｓｉ－９

［（８．６±２．１）／ＨＰＦ］（图６Ｄ）与Ｐａｎ

ｅｚｓｉ—ｓｃｒｆｌｌＴＩ

［（３２．３±２．８）／ＨＰＦ］（图６Ｃ）相比细胞的侵袭能力

下降了７３．４％（Ｐ＝０．００１６）。

近年学者发现Ｅｚｒｉｎ的高表达可以促进多种肿

瘤的转移¨引，Ｅｚｒｉｎ可能是某些肿瘤基因治疗的潜

在靶点。越来越多的研究表明Ｅｚｒｉｎ在肿瘤细胞的

生物学行为中发挥着重要的作用＂ｌ我們采用载

体介导的方法干扰胰腺癌细胞内Ｅｚｆｉｎ的表达，试

图为胰腺癌的基因治疗提供一个新的治疗靶点

我们发现，Ｅｚｒｉｎ表達的敲减对胰腺癌的生长速

度没有明显的影响同样对细胞周期的影响也不明

显，这与先前的报道一致∞Ｊ干扰Ｅｚｒｉｎ的表达可

导致胰腺癌细胞系Ｐａｎｅ．Ｉ细胞的表面微绒毛和细

图５扫描电镜观察Ｅｚｒｉｎ表达下调的对细胞表面形态的影响

ｅｚｓｉ－ｓｃｌ＇ａｍ．Ｂ：Ｐａｎ

ｅｚｓｉ－８ｃｒａｎｌ，Ｂ：Ｐａｎ

ｅ∞ｉ．９）及侵袭实验（Ｃ：Ｐａｎ

ｅｚｓｉ．ｓｃｒａｒａＤ：Ｐａｎ

胞突起明显减少，提示Ｅｚｒｉｎ可能通过影响与Ｆ—ａｃｔｉｎ

的结合导致细胞骨架的重排进一步说明Ｅｚｒｉｎ在

细胞形态的维持和細胞运动方面发挥着重要的作

用。作为细胞骨架的主要成员Ｆ一肌动蛋白丝存在

于胞膜的内面，但与胞膜并不直接接触Ｅｚｒｉｎ便昰

连接肌动蛋白丝与胞膜的重要物质之一，参与亚细

胞骨架构建和接触识别等重要功能‘Ｉ－２￥Ｊ。Ｅｚｒｉｎ为

连接细胞骨架及细胞膜的细胞骨架连接蛋白这可

使得细胞可以直接与其所处的微环境相互作用，并

且使信号通过一系列的生长因子受体和黏附分子转

导進而影响细胞的运动和侵袭。８‘９

软琼脂集落形成率测定细胞的非贴壁依赖性生

长能力文献报道，软琼脂集落形成率高的瘤细胞

其轉移能力较强。这种现象表示瘤细胞离开原发

灶、在远处组织器官的生长能力较强较易形成转移

瘤¨ｍ屹ｊ。我们发现，干扰Ｅｚｒｉｎ表达后Ｐａｎｃ—ｌ细胞

软琼脂集落形成率比对照细胞减少，提示干扰Ｅｚｒｉｎ

表达使细胞的非锚定依赖性生长能力减弱抗失巢

凋亡的能力减弱，形成转移瘤的能力减弱

细胞迁移是一个复杂的过程，需要细胞、细胞外

环境和细胞骨架系统之间动态的、协调的相互作

２引。Ｅｚｒｉｎ是一种细胞骨架连接蛋白活化的

Ｅｚｒｉｎ羧基端与肌动蛋白细胞骨架连接，其氨基端则

可于多种跨膜分子结合如ＣＤ４４、ＩＣＡＭ．１、Ｅ．ｃａｄｈｅｒｉｎ

等参与细胞结构组建和细胞信号传递过程¨之Ｊ。

Ｅｚｒｉｎ参与的细胞骨架重排系統可能在细胞的运动

过程中发挥作用，Ｅｚｒｉｎ可能通过与肌动蛋白的结合

导致细胞运动能力的改变…

细胞穿过基底膜而侵袭，一方媔需要通过细胞

骨架重组细胞伸出伪足而向前迁移１８【，另一方面

需要对周围的细胞外基质进行降解。Ｅｚｒｉｎ的表达

下调可能會降低Ｐａｎｃ．１细胞分泌基质降解酶而导

致细胞的侵袭能力下降其机制还需研究’７。

总之我们认为Ｅｚｒｉｎ在调节细胞的形態、细胞

骨架的重排、运动以及细胞体外非锚着依赖性的生

长、转移灶的形成和稳定、运动和侵袭等方面发挥着

重要的作用。针对Ｅｚｒｉｎ的基因治疗有望在抑制胰

腺癌的运动和转移方面发挥重要的作用

：１］Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ

ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒｓ

Ｂｉｎｌ，２００２３（８）：

Ｎ，Ｎａｇａｆｕｃｈｉ

Ｅｚｆｉｎ．ｒａｄｉｘｉｎ

Ｉｏｅａｌｉｚａｔｉｏｎ

ｆｉｌａｍｅｎｔ／ｐｌａｓｍａ

ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ

１９９２１０３（Ｐｔ

１）：１３１．１４３．

Ｍ．ＭｃＣｌａｔｃｈｅｙ

Ｃｅｌｌ．２伽１４．５（２）：１１３－１１４．

［４］伽Ｊ，Ｚｈａｎｇ

Ｊ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ

ｔｉｓｓｕｅ．Ｔｕｍｏｕｒ

Ｉ．３２（６）：１２４Ｉ－

１ｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ

ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ａｎｎ

Ｉ．１５（６）：３９４－

ａ１．Ｐｈａｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ

ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ

Ｒｅｐｏａ２０１２，５（Ｉ）：１７－

Ｍｅｄ２０１０．８：６Ｉ．

Ｐ．Ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ：ａｔ

Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００８１５（７）：７２５．７３７．

Ｍ，Ｃｈｉｆｉｖｉｎｏ

ａ１．Ｅｍｅｒｇｌｎｇ

ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ

（２）：１９９－２０６．

ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ

Ｇｕｔ．２００９．５８（２）：２７１－２８４．

ａ１．Ｍｅｔａｓｌ＆ｃｉｓ－ａｓｓｏｅｉａｔｅｄ

ｏｓｔｅａｓａｒｃｏｍａ．

Ｒｅｓ，２００ｌ６Ｉ（９）：３７５０－３７５９．

ｋ１１．２００８，２６ｌ（Ｉ）：５５－６３．

（收稿日期：２０１２－０３－２７）

主堡痘理堂盘查垫！！堡！！旦筮！！鲞箜！！塑鱼垡！』堕尘虫堡竺！里！塑；！！！：ｙ！！：！！盟！：！！

ＲＮＡ干扰Ｅｚｒｉｎ蛋白表达对胰腺癌细胞系

Ｐａｎｅ一１细胞生物学行为的影响

目的探讨ＲＮＡ干扰Ｅｚｒｉｎ对胰腺癌胞系Ｐａｎｅ＋１细胞生物学行为的影响。方法建

立靶向Ｅｚｒｉｎ干扰质粒稳定转染Ｐａｎｅ一１细胞，并用流式细胞术检测细胞周期ＣＣＫ．８法检测细胞增

殖情况，扫描电镜观察细胞表丽形态及表面突起的变化软琼脂克隆形成实验检测细胞体外非锚着依

赖性的生长能力，用未包被及包被Ｍａｔｒｉｇｅｌ胶的Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室分别检测细胞的运动和侵袭能力

结果ＲＮＡ干扰Ｅｚｆｉｎ后其蛋白的表达明显下降，Ｐａｎｅ．１表面的细胞突起、微絨毛数量明显减少体

外非锚着依赖性的生长能力也明显下降，运动及侵袭能力也明显下降但对细胞的体外增殖和细胞周

期没有明显的影响。结论Ｅｚｒｉｎ蛋白的表达对胰腺癌细胞的细胞突起、表面微绒毛的形成、细胞骨

架及非锚着依赖性的生长发挥着重要的作用干擾Ｅｚｆｉｎ的表达将对胰腺癌细胞的表面突起的形成、

细胞骨架以至细胞运动及在转移灶的存活中起着重要的作用。

【关键词】胰腺肿瘤；细胞骨架；肿瘤细胞培养的

ＭＥＮＧ地ｎ—ｘｉａｏ．ＹＵ

Ｓｈｕａｎｇ—ｎｉ．￡Ｕ

Ｚｈａｏ—ｈｕｉ，ＣＨＥＮ

Ｊｉｅ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ

ＰａｔｈｏｌｏｇｙＰｅｋｉｎｇ

Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｈｉｎｅｓｅ

ＳｃｉｅｎｃｅｓＰｅｋｉｎｇ

Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅ柳ｎｇ

１００７３０Ｃｈｉｎａ

Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ

ａｕｔｈｏｒ：ＣＨＥＮ

Ｊｉｃ，Ｅ—ｍａｉｆ：ｘｈｂｌｋ＠１６３．ｃｏｒｎ

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ

Ｐａｎｅ一１．Ｍｅｔｈｏｄｓ

ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ

ｐｌａｓｍｉｄ．Ｔｈｅ

ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ

ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ

ｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎｓ／ｍｉｃｒｏｖｉｌｌｉ

ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｃｏｌｏｎｙ

ａｎｃｈｏｒ．ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ

ｖｉｔｒｏ．Ｔｒａｎｓ．ｆｉｌｔｅｒ

ｗｉｔｌｌ／ｗｉｔｈｏｕｔ

ｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎｓ／ｍｉｃｒｏｖｉｌｌｉ

ｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｃｈｏｒａｇｅ—ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ

ｇｒｏｗｔｈ，ｃｅｌｌ

ｉｎｖａｓｉｏｎｂｕｔ

ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ

Ｐａｎｅ．１．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ

ｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎｓ／ｍｉｃｒｏｖｉｌｌｉ

ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ａｎｃｈｏｒａｇｅ—ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ

ｇｒｏｗｔｈｃｅｌｌ

ｗｏｒｄｓ】Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ

Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ；Ｔｕｍｏｒ

ｃｅｌｌ，ｃｕｌｔｕｒｅｄ

Ｅｚｒｉｎ为一种胞质内的细胞骨架蛋皛属于

ＥＲＭ（Ｅｚｒｉｎ．ｒａｄｉｘｉｎ—ｍｏｅｓｉｎ）家族，由Ｖｉｌ２基因编码

在细胞骨架和细胞膜之间起连接作用¨Ｊ，参与细胞

形态改变、细胞膜结构组建、细胞运动、黏附及相关

信号转导，在肿瘤细胞运动、黏附、侵袭中发挥重要

作用心ｊ胰腺癌细胞极强的侵袭和转移能力与患

ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０５２９－５８０７．２０１２．１２，００９

基金项目：国家自然科学基金（３０４７１９７０）；国家科技支撑计划

（２００６ＢＡｌ０２Ａ１４）；卫生行业科研专项课题（２００８０２０１１）

作者单位：１００７３０中国医学科学院北京协和医学院北京协和

通信作者：陈杰Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｈｂｌｋ＠１６３．ｃｏｎ

者预后差直接相关。有学者发现Ｅｚｒｉｎ的高表达可

以促进多种肿瘤的转移∞Ｊ可能是某些肿瘤基因治

疗的潜在靶点。越来越多嘚研究表明Ｅｚｒｉｎ在肿瘤

细胞的生物学行为中发挥着重要的作用［３－７］ＲＮＡ

ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）是同源性双链ＲＮＡ

ＲＮＡ）介导的转录后基因

沉默（ｐｏｓｔ—ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ

ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）能够特异

高效的降解靶基因的ｍＲＮＡ，因而在抗肿瘤治疗方

面显示了巨大的潜力和良好的应用前景我们旨在

利用ＲＮＡｉ技术对胰腺癌细胞系Ｐａｎｅ．１细胞中

Ｅｚｒｉｎ的表达进行干预，进而探讨Ｅｚｒｉｎ对胰腺癌生

！ｉ！垡瘟理芏苤查垫！！生！！』！筮兰！鳖笙！！塑鱼丛！』！塑型：！！！！！：！！坠！垫！！：！塑：兰！！∑：！！

１．材料：人胰腺癌Ｐａｎ（?一１、ＭＩＡ

ＰａＣａ．２、ＡｓＰＣ．１、

ＢｘＰＣ一３细胞系Ｆｆｌ美同标准仨物品保存巾心

ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）提供胰腺

细胞系Ｐｃ—ｌ、ＰＣ－２、ＰＣ一３、ＰＣ－４、ＰＣ－７为我室Ｉ，Ｉ建

２．１一Ｕ６载体为中国医学科学院医学基础

研究所张强博士惠赠Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室购自美旧

Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ公ｆｊＪ。兔抗人多克隆抗体Ｅｚｒｉｎ购

自Ｕｐｓｔａｔｅ公司．鼠抗人单克隆抗体ＧＡＰＤＨ购Ｊｉ

Ｃｒｕｚ公司。ＨＲＰ标记的山羊抗兔、山羊抗小

鼠ＩｇＧ购自北京巾杉金桥生物技术有限公司二

２．Ｅｚｒｉｎ—ｒ扰序列的设計、化学合成及载体的

构建：利用Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ网站提供的设汁ｔ具根据

ｓｈＲＮＡ的设计原则设计两对特异性抑制Ｅｚｒｉｎ嘚序

５’．（；ＧＧＣＣＡＡＧＵＵＣＵＡＣＣＣＵＧＡＡＧ．３’．

Ｌ－ＵＵＣＣＵＵＧＧＡＧ

一对编码核苷酸的序列打乱顺序后的序列（№．３：

５’－ＧＡＵＣＣＧＡＣＵＣＣＧＡＡＧＵＣＡＧＣＵ一３

列经序列比对未发现该序列与任何已知基闪同源．．

化学合成仩述序列的ｓｈＲＮＡ后，经Ｉ二扰胰腺癌细胞

系Ｅｚｒｉｎ蛋白表达验证其有效性后将有效序列及

对照序列导入真核表达载体ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ

将有效序列及其互补序列中间加一个９个碱基的

环，分别合成后插入到载体ｐＳｉｌｅｍ?ｅｒ

ＩＩＩ酶切位点之间；同样嘚方法建

立对照载体；通过测序验证插入序列的正确性

３．细胞培养、转染及稳定转染细胞系的建立：

胰腺癌细胞系以含１０％胎牛Ｉ缸清ＤＭＥＭ培养液培

养，置于３７℃含５％ＣＯ温箱巾。细胞以５

１０５／：ｆＬ的密度种植于六孔板巾所有的转染均ＪＨ

ｌｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ

２０００介导，转染后２４

ｍｇ／Ｌ）加入培养液中用于稳定转染细胞系的

建‘萨每２—３天换液一次，约２—３周後稳定转染

Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ一８）法测定细胞乍长

曲线：细胞以ｌ×１０’每孔种植Ｆ

２１个孑Ｌ设３个平行孑Ｌ。每组每天分别測３孔每孔

加入ＣＣＫ．８试剂１０

ｈ后检测４５０ ｎｍ的吸光度

（Ａ）值，参比波长为６３０

５．检测细胞周期：不同分组细胞培养４８

酶消化收集细胞；以７０％乙醇吲定过夜：ｌ％１１Ｉ．ｉｔｏｎ

Ｘ一１００（Ｖ／Ｖ）５斗ｌ１

加碘化丙啶（溶解于ＰＢＳ，终濃度为５０

ｎｆｉｎ．收获的细胞密度不低于ｌ

ｎｍ测量细胞ＤＮＡ含量：

６．软琼脂克隆形成实验：超净［作台混合配置

上层及下层琼脂培养液：下层培养液含有０．５％软

琼脂＋ｌ×ＤＭＥＭ培养液＋１０％胎牛ｍ清；ｔ－．层培

养液含有０３５％软琼脂＋ｌ×ＤＭＥＭ培养液＋１０％

胎牛ｍ清；首先铺下层软琼脂培养液．向２４孔板每

ｍＩ底层琼脂，静置凝周将上层软琼脂

培养液分装至离心管ｒｆＩ每管１．５

细胞，混匀后平均加入３孑Ｌ铺有下层软琼脂的２４孔

ｏＣ５％ＣＯ！培养箱培养３周；倒置显微镜

下汁算每孑Ｌ的克隆数和克隆形成碍《。

７．扫描电镜：细胞以５

ｈ后以ＰＢＳ洗；２．５％戊二醛同定室温

ｒａｉｎ左右；ＰＢＳ洗；ｌ％ＯｓＯ．后凅定ｌ～２

梯度乙醇或丙酮脱水；临界点ｆ燥或冷冻干燥；喷镀

碳与金；扫描电镜观察，照相

８．细胞迁移和侵袭能力分析：细胞迁移通過具

有聚碳酸酯微孔滤膜（孑Ｌ径８“ｍ）的Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室

１０４个细胞．ｊ目无ｍ清ＤＭＥＭ

培养液重悬下室内置５００

ｔｔｌ含有１０％ｌｉｌｔ清的

ＤＭＥＭ作为化学趋化物。对细胞侵袭能力分析ｊＨ

Ｍａｔｒｉｇｅｌ包被的侵袭小室分别培养１２或２４

用棉拭子去除上室底部基质胶并移除未穿透细胞，

而迁移和侵袭的细胞经过Ｉ司定后以结晶紫染色．选

择５个２００倍湿微视野统计總细胞数以迁移细胞

的相对数目表示肿瘤细胞的迁移能力；每组设３个

平行样本，取其平均值行统计学分析．

９．统计学方法：每种實验至少重复３次：

所有数据以ｉ±ｓ表示，两样本问均数的比较用独晓

样本ｔ检验，同一组不同处理均数比较用配对资料

检验。数据處理应片Ｊ

Ｐ＜０．０５表示差异有统汁学意义：

ｂｌｏｔ检测９株胰腺癌细胞系Ｅｚｒｉｎ表

达情况：取９株胰腺细胞系ＰＣ—ｌ、Ｉ）Ｃ．２、ＰＣ－３、ＰＣ－４、

ＰＣ－７、Ｐａｎｅ—ｌ、ＢｘＰＣ一３、ＡｓＰＣ－ｌ、ＭＩＡ

蛋白（２０“ｇ／孔）．』Ｈ扰Ｅｚｒｉｎ的多克隆抗体进行

ｂｏｈ检测并以ＧＡＰＤＨ作为内参照，Ｅｚｒｉｎ

存９种胰腺癌细胞系ｒｆｌ均呈较强表达（图１）

２．〣化学合成法验诅：干扰位点的有效性：分刖

将化。浮合成的小ＲＮＡ（ＮＯ．１和ＮＯ．２）及对照小

ＲＮＡ（Ｎ（）．３）ＪＩ

Ｌｉｐｏｆｅｅｔａｍｉｎｅ

２０００转染胰腺癌细胞

ｌ＇．＇ｚｒｉｎ■—●●—●●—●■—■●＿●－＿＿■一●—■

ＧＡＩ＂ＤＩｌ’－●一●———－●●－●－●－－＿ｉｍｍ．ｍ－－

ｌ：ＰＣ．１２：ＰＣ?２，３：ＰＣ－３４：ＰＣ４，５：ＰＣ－＇／６：Ｐａｎｅ－ｌ，７：ＢｘＰＣ?

３．８：ＡｓＰＣ－ｌ９：ｂｌｌＡ

Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测９株胰腺癌细胞系Ｅｚｒｉｎ表達情况

系Ｐａｎｅ．１细胞，７２

Ｅｚｒｉｎ表达的改变发现Ｎｏ．２化学合成的小ＲＮＡ干

扰效果最优（图２），遂将根据其序列构建的干扰载

体用于后续的干扰试验

１ｍ１●～＿洲“一。一

ＣＡｔ，Ｉ）ｔｔ●—●＿●◆ＧＡ｝’ＤＨ■—■—■—◆●—一Ｉ

ｂｌｏｔ检测化学合成的小干扰ＲＮＡ千扰位点的有

效性（Ｍ：标志物ｌ：小ＲＮＡ

Ｎｏ．１．２：小ＲＮＡ

Ｎｏ．２，３：小ＲＮＡ

ｂｌｏｔ检测Ｅｚｒｉｎ稳定干扰细胞系的有效性

（１：Ｐａｎｅｚｓｉ．ｓｃ硼２：Ｐａｎｅｚｓｉ－２．３：Ｐａｎｅｚｓｉ－９）

３．Ｅｚｒｉｎ稳定干扰细胞系的建立：采用干扰效应

最强的Ｎｏ．２靶序列及对照Ｎｏ．３序列构建干扰载

体ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．１．Ｕ６

Ｎｏ．２质粒和对照ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．Ｉ—

Ｎｏ．３质粒，分别转染Ｐａｎｅ—ｌ细胞并用Ｇ４１８筛

选Ｃ，４１８筛選的细胞克隆的效果通过免疫印迹来

评定获得稳定转染细胞系Ｐａｎ

ｅｚｓｉ－ｓｃｒｌｔｍ（对照）、

ｅｚｓｉ－９。免疫印迹皆显礻相对于ｘ：ｔＮ

细胞，稳定转染细胞系Ｐａｎ

ｅｚｓｉ－９的Ｅｚｒｉｎ

表达明显下降经光密度分析显示，Ｐａｎ

ｅｚｓｉ－９的Ｅｚｒｉｎ表达分别下降了４８．７％及９６．７％而

ｅｚｓｉ－９的Ｅｚｒｉｎ蛋白表达下降更明显，因此将该

克隆用于后续的实验（图３）

４．Ｅｚｒｉｎ敲减表达对细胞增殖的影响：用ＣＣＫ－８

ｅｚｓｉ．ＳＣｌ＇ｌｌｍ和Ｐａｎ

ｅｚｓｉ－９细胞的增殖能

力，发现Ｅｚｒｉｎ表达下调后对细胞的增殖能力没有

５．Ｅｚｒｉｎ敲减表达对细胞周期的影响：流式细胞

术检测细胞周期发现Ｐａｎ

ｅｚｓｉ－９的Ｇ。期细胞比例

ｅｚｓｉ一８ｃｒｌｔｍ为６５．１％它们之间的差

异没无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。Ｐａｎ

ｅｚｓｉ－９的Ｇ２／Ｍ

期细胞比例为１９．７％Ｐａｎ

ｅｚｓｉ－ｓｃｒａｍ为２３．０％，差

异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）ｓ期細胞比例，Ｐａｎ

ｅｚｓｉ－９为１５．４％对照细胞为１１．８％，差异无统计

学意义（Ｐ＝０．０６）数据分析表明，Ｅｚｒｉｎ的表达敲

减对细胞周期没有明显的影响

６．软琼脂克隆形成率分析：Ｐａｎ

ｅｚｓｉ－ｓｃｒａｍ细胞

ｅｚｓｉ－９细胞，分别培养３周后发现Ｐａｎ

￥ｅｒａｍ细胞克隆形成率为（１０．５±０．８）％，Ｐａｎ

９克隆形成率为（４．８±０．９）％，两者的差异有统计

学意义（Ｐ＝Ｏ．００８３）Ｅｚｒｉｎ表达下调后细胞克隆形

成率降低了５４．３％。

ＣＣＫ－８法测定Ｅｚｒｉｎ敲减表达对細胞增殖的影响

７．形态学改变：为探讨Ｅｚｒｉｎ敲减表达是否参

与了细胞骨架的重构用扫描电镜观察Ｅｚｒｉｎ表达

下调的稳转细胞形态的改变。相对于对照细胞稳

ｅｚｓｉ－９的细胞突起和微绒毛明显

减少，而对照细胞Ｐａｎ

ｅｚｓｉ．ｓｅｒｌｌｍ的细胞突起囷微绒

毛较多且更长（图５）

８．细胞迁移和侵袭能力分析（图６）：细胞迁移

能力实验显示迁移到下层小室的Ｐａｎ

ｅｚｓｉ－９（圖６Ｂ）

的细胞数量是（１１．３．４－４．２）／ＨＰＦ，而对照Ｐａｎ

８ｃｒａｍ细胞（图６Ａ）为（１２４．３±２１．３）／ＨＰＦ。定量分

析表明Ｅｚｒｉｎ敲减表达后迁移到下室的细胞减少了

９１．Ｉ％（Ｐ＝０．００００３）细胞侵袭实验显示Ｐａｎｅｚｓｉ－９

［（８．６±２．１）／ＨＰＦ］（图６Ｄ）与Ｐａｎ

ｅｚｓｉ—ｓｃｒｆｌｌＴＩ

［（３２．３±２．８）／ＨＰＦ］（图６Ｃ）相比细胞的侵袭能力

下降了７３．４％（Ｐ＝０．００１６）。

近年学者发现Ｅｚｒｉｎ的高表达可以促进多种肿

瘤的转移¨引，Ｅｚｒｉｎ可能是某些肿瘤基因治疗的潜

在靶点。越来越多的研究表明Ｅｚｒｉｎ在肿瘤细胞的

生物学行为中发挥着重要的作用＂ｌ我們采用载

体介导的方法干扰胰腺癌细胞内Ｅｚｆｉｎ的表达，试

图为胰腺癌的基因治疗提供一个新的治疗靶点

我们发现，Ｅｚｒｉｎ表達的敲减对胰腺癌的生长速

度没有明显的影响同样对细胞周期的影响也不明

显，这与先前的报道一致∞Ｊ干扰Ｅｚｒｉｎ的表达可

导致胰腺癌细胞系Ｐａｎｅ．Ｉ细胞的表面微绒毛和细

图５扫描电镜观察Ｅｚｒｉｎ表达下调的对细胞表面形态的影响

ｅｚｓｉ－ｓｃｌ＇ａｍ．Ｂ：Ｐａｎ

ｅｚｓｉ－８ｃｒａｎｌ，Ｂ：Ｐａｎ

ｅ∞ｉ．９）及侵袭实验（Ｃ：Ｐａｎ

ｅｚｓｉ．ｓｃｒａｒａＤ：Ｐａｎ

胞突起明显减少，提示Ｅｚｒｉｎ可能通过影响与Ｆ—ａｃｔｉｎ

的结合导致细胞骨架的重排进一步说明Ｅｚｒｉｎ在

细胞形态的维持和細胞运动方面发挥着重要的作

用。作为细胞骨架的主要成员Ｆ一肌动蛋白丝存在

于胞膜的内面，但与胞膜并不直接接触Ｅｚｒｉｎ便昰

连接肌动蛋白丝与胞膜的重要物质之一，参与亚细

胞骨架构建和接触识别等重要功能‘Ｉ－２￥Ｊ。Ｅｚｒｉｎ为

连接细胞骨架及细胞膜的细胞骨架连接蛋白这可

使得细胞可以直接与其所处的微环境相互作用，并

且使信号通过一系列的生长因子受体和黏附分子转

导進而影响细胞的运动和侵袭。８‘９

软琼脂集落形成率测定细胞的非贴壁依赖性生

长能力文献报道，软琼脂集落形成率高的瘤细胞

其轉移能力较强。这种现象表示瘤细胞离开原发

灶、在远处组织器官的生长能力较强较易形成转移

瘤¨ｍ屹ｊ。我们发现，干扰Ｅｚｒｉｎ表达后Ｐａｎｃ—ｌ细胞

软琼脂集落形成率比对照细胞减少，提示干扰Ｅｚｒｉｎ

表达使细胞的非锚定依赖性生长能力减弱抗失巢

凋亡的能力减弱，形成转移瘤的能力减弱

细胞迁移是一个复杂的过程，需要细胞、细胞外

环境和细胞骨架系统之间动态的、协调的相互作

２引。Ｅｚｒｉｎ是一种细胞骨架连接蛋白活化的

Ｅｚｒｉｎ羧基端与肌动蛋白细胞骨架连接，其氨基端则

可于多种跨膜分子结合如ＣＤ４４、ＩＣＡＭ．１、Ｅ．ｃａｄｈｅｒｉｎ

等参与细胞结构组建和细胞信号传递过程¨之Ｊ。

Ｅｚｒｉｎ参与的细胞骨架重排系統可能在细胞的运动

过程中发挥作用，Ｅｚｒｉｎ可能通过与肌动蛋白的结合

导致细胞运动能力的改变…

细胞穿过基底膜而侵袭，一方媔需要通过细胞

骨架重组细胞伸出伪足而向前迁移１８【，另一方面

需要对周围的细胞外基质进行降解。Ｅｚｒｉｎ的表达

下调可能會降低Ｐａｎｃ．１细胞分泌基质降解酶而导

致细胞的侵袭能力下降其机制还需研究’７。

总之我们认为Ｅｚｒｉｎ在调节细胞的形態、细胞

骨架的重排、运动以及细胞体外非锚着依赖性的生

长、转移灶的形成和稳定、运动和侵袭等方面发挥着

重要的作用。针对Ｅｚｒｉｎ的基因治疗有望在抑制胰

腺癌的运动和转移方面发挥重要的作用

：１］Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ

ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒｓ

Ｂｉｎｌ，２００２３（８）：

Ｎ，Ｎａｇａｆｕｃｈｉ

Ｅｚｆｉｎ．ｒａｄｉｘｉｎ

Ｉｏｅａｌｉｚａｔｉｏｎ

ｆｉｌａｍｅｎｔ／ｐｌａｓｍａ

ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ

１９９２１０３（Ｐｔ

１）：１３１．１４３．

Ｍ．ＭｃＣｌａｔｃｈｅｙ

Ｃｅｌｌ．２伽１４．５（２）：１１３－１１４．

［４］伽Ｊ，Ｚｈａｎｇ

Ｊ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ

ｔｉｓｓｕｅ．Ｔｕｍｏｕｒ

Ｉ．３２（６）：１２４Ｉ－

１ｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ

ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ａｎｎ

Ｉ．１５（６）：３９４－

ａ１．Ｐｈａｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ

ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ

Ｒｅｐｏａ２０１２，５（Ｉ）：１７－

Ｍｅｄ２０１０．８：６Ｉ．

Ｐ．Ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ：ａｔ

Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００８１５（７）：７２５．７３７．

Ｍ，Ｃｈｉｆｉｖｉｎｏ

ａ１．Ｅｍｅｒｇｌｎｇ

ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ

（２）：１９９－２０６．

ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ

Ｇｕｔ．２００９．５８（２）：２７１－２８４．

ａ１．Ｍｅｔａｓｌ＆ｃｉｓ－ａｓｓｏｅｉａｔｅｄ

ｏｓｔｅａｓａｒｃｏｍａ．

Ｒｅｓ，２００ｌ６Ｉ（９）：３７５０－３７５９．

ｋ１１．２００８，２６ｌ（Ｉ）：５５－６３．

（收稿日期：２０１２－０３－２７）