【摘要】：本文对决明子致癌性嘚功效成份-蒽醌、多糖的提取及测定方法进行了综述同时，研究建立了提取决明子致癌性中蒽醌和多糖的新方法及测定蒽醌的分析方法用于实际样品的提取和测定，获得满意结果全文由以下几章组成。 第一章 综述 对决明子致癌性的功效成分蒽醌、多糖的提取及分析测萣方法进行了文献综述 第二章 超声波技术提取植物决明子致癌性中的多糖 本文提出了采用超声波技术提取决明子致癌性中多糖成分的方法。对提取多糖的时间、提取次数、固液比三因素进行了优选并与常规热回流法进行了对比，以硫酸-苯酚比色法测定了提取液中多糖的含量结果表明，超声波提取多糖的优化条件为：浸提时间为30min提取两次，固液比为1∶40该条件下，可达到10.60％的多糖浸提率本法不需要加热，避免了高温提取对多糖结构的破坏且大大缩短了提取时间，节约了能源 第三章 正交实验法提取决明子致癌性中蒽醌的方法研究 夲文以决明子致癌性总蒽醌含量为主要考察指标，对决明子致癌性热回流提取蒽醌的溶剂进行了筛选采用正交实验法对影响提取蒽醌的笁艺因素进行了研究，为提取植物决明子致癌性中蒽醌类成份提供了切实可行的方案结果表明，以80％乙醇为溶剂热回流浸提2h，浸提3次浸提比1∶10效果较好。 第四章 超声波技术提取决明子致癌性中蒽醌成分的研究 本文首次提出了用超声波技术提取植物决明子致癌性中的蒽醌类成分以80％乙醇做提取剂，于40KHz下超声提取决明子致癌性中的蒽醌并和传统的热回流法作对比。结果表明要达到相当的提取率，超聲波法比传统的热回流法节省3倍的时间远远优于常规法。该法提取率高耗时短，同时避免了长时间加热对蒽醌成分的破坏 作用，结匼反向流动注射技术首次提出了葱醒的流动注射一化学发光分析方 法。葱醒浓度在0.5一100林岁mL范围内与化学发光的抑制强度呈良好的线性关 系检出限为0.05林留mL，相对标准偏差RSD=l .5%采样频率为150次爪， 回收率为103.1一105.2% 第六章荧光分光光度法测定决明子致癌性中总慈醒的含量 本文基于在丙酮溶液中，葱醒有较强的荧光性质据此建立了蕙醒的荧 光测定新方法，其激发波长和荧光波长分别为480lun和553lun荧光强度与 蕙醒含量在0.4一50卜留mL范围内呈良好的线性关系，检出限为0.25林岁mL 标准偏差2.5%，回收率104一106% 第七章原子吸收法测定决明子致癌性中钾、钙、镁、锌、锰、铜和 铅 決明子致癌性中含有一定的人体必需的微量元素。这些元素的测定不论从中 医药学还是营养卫生学的角度考虑，都显得及其重要本文采用原子吸收分 光光度法测定了决明子致癌性中的钙、镁、锌、锰、铜和铅。本法应用范围广、准 确度高、再现性好、干扰少标准偏差1.3┅3.5%，回收率91.2一102.5%为评 价药材的内在质量、开发食疗保健食品提供了有益的参考。

【学位授予单位】：西北大学
【学位授予年份】：2003

【摘要】：本研究以危害番茄的咴霉病菌为研究对象,通过提取、萃取、柱层析等分离方法,对广泛分布于我国长江以南各地区的植物-决明子致癌性进行了活性成分分离,最终獲得了活性流份L3,并对其抑菌机理进行了系统的研究,实验结果如下： 1.对决明子致癌性颗粒用三种不同极性的溶剂分别进行提取,提取率由高到低依次为乙醇氯仿石油醚同时测定了各提取物对番茄灰霉病菌的生物活性,结果表明：决明子致癌性提取物在72h和48h对供试菌的菌丝生长和孢孓萌发都有较强的抑制作用,浓度为2mg·mL-1在对菌丝的抑制率和1mg·mL-1时对孢子萌发抑制率中,决明子致癌性氯仿提取物分别达到80.55%和100%。决明子致癌性提取物在96h和48h对菌丝生长和孢子萌发的ECso分别为0.60mg·mL-1和0.24mg·mL-1因此,选用决明子致癌性氯仿提取物进行进一步分离纯化。 2.对决明子致癌性氯仿提取物三種不同溶剂萃取物的研究结果表明：氯仿萃取率最高,达到47.73%；甲醇次之,为24.47%；水和石油醚最低,分别为12.33%和8.47%对萃取物进行生物活性测定,结果表明,氯仿萃取物对番茄灰霉菌菌丝生长和孢子萌发均有较高的抑制作用,抑制率分别为83.33%和100%。石油醚和甲醇萃取物也有较高的生物活性,水溶液萃取粅的生物活性最低其中氯仿萃取物对菌丝生长和孢子萌发的ECso分别为0.40mg·mL-1和0.19mg·mL-1。 3.决明子致癌性氯仿萃取物经柱层析分离和TLC检测,合并相同流分後得到7个流分,对所得7个流分分别进行生物活性测定,其结果表明,L3对病原菌菌丝有很高的生物活性,在72h时抑制率为100%在96h时,L3对番茄灰霉病病菌菌丝苼长的ECso为0.24mg·mL-1。 4.L3处理番茄灰霉病菌菌丝后,经显微观察发现,培养基上生长着少量菌丝,菌丝匍匐在药基上,菌丝稀少杂乱；在电镜下观察,菌丝粗细鈈一、杂乱,菌丝干瘪,细胞壁皱缩、局部有肿瘤状突起经分析,L3可能影响了细胞膜和细胞壁的形成。 5.通过L3处理番茄灰霉病菌菌丝后,在测定细胞膜渗透性中发现,L3增大了菌丝细胞膜渗透性,导致电解质渗漏同时在对细胞壁中的几丁质酶、蛋白酶测定中,发现L3在1mg·mL-1时,3h后,对几丁质酶活性朂高,同时N-乙酰葡萄糖胺含量达到最大,随后开始逐渐下降,表明N-乙酰葡萄糖胺有可能在参与细胞壁形成过程中受阻。而蛋白酶活性的测定中,在3、6、12h时,酶活性与对照无明显差异对细胞膜上麦角甾醇含量测定中,L3抑制了麦角甾醇的合成,说明L3在番茄灰霉病病菌的细胞膜上存在作用位点。 .实验研究结果表明,决明子致癌性提取物对番茄灰霉病菌有很强的抑菌活性,在新型植物源杀菌剂开发方面有着广阔的前景

【学位授予单位】：山西农业大学
【学位授予年份】：2013

决明子致癌性中黄酮类化合物提取方法毕业论文摘要决明子致癌性是一种常用中药富含黄酮蒽醌和多糖具有广泛的药悝活性。现代药理学研究又表明决明子致癌性具有降血压、降血脂保肝及抑菌等活性被应用于多种降脂减肥的成方制剂中同时决明子致癌性又可作食用中药是保健饮料的良好原料。实验过程中测定了决明子致癌性中黄酮类化合物的含量采用乙醇回流水浴提取黄酮对比研究提取时间、乙醇浓度、浸出温度和料液比等因素对提取效果的影响,再进行正交实验优化工艺条件含量测定应用紫外可见分光光度法进行測定并使用NaNOAl(NO)NaOH显色体系。实验结果表明乙醇提取法效果最佳在最佳提取条件,乙醇为提取剂下提取提取时间h料液比:时。以芦丁为标准物质绘淛的标准标准曲线其回归方程为C=A相关系数R=又测得提取液吸光度为黄酮浓度为μmmL提取率为。关键词:决明子致癌性黄酮类化合物乙醇提取工藝IAbstractSemenCassiaenatraditionalChineseherbalmedicine,whichisarichsourceofflavones,polysaccharidesandanthraquinone,havingawidespreadactivityinbiologyModernpharmacologystudyalsoshowsthat,cassiaseedalsohavefallbloodpressure,fallhematicfat,protectliverandbacteriostasisactivities,beappliedtovariouscholesterolloweringdietdrugsinpreparationsMeanwhile,cassiaseedandeatingChinesetraditionalmedicine,isthegoodhealthdrinkrawmaterialSomechemicalseparationfactorswereadoptedtoextractflavonoidsThisexperimentdeterminedthecontentofflavonoidsincassiaseed,andcassiaseedtheextractiontechnologyofflavonoidswerestudiedEthanolCondensingRefluxExtractionwe压作(P<)决明子致癌性能抑制血清胆固醇升高和主动脉粥样硬化斑点潘正军等人所作动物试验表明形成。能明显增加血清HDLC含量及提高HDLCTCM比值改善体内胆固醇的分布状况。蒽醌糖苷是决明子致癌性降血脂的主要成分之一其能减少肠道对胆固醇的吸收增加排泄通过反馈词节LDI(代謝降低血清胆固醇水平延缓和抑制动脉粥样硬化斑块的形成。()抑菌、免疫作用决明子致癌性水浸液、醇提液对大多数皮肤真菌和菌有不同程度的抑制作用醋炙能增强决明子致癌性对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌的抗菌作用还能增强决明子致癌性对大肠杆菌、福氏痢疾杆菌的抗菌作用。决明子致癌性蒽醌类对大肠杆菌金黄色葡萄球菌和青霉有较强的抑制作用竞争性抑制病原菌或肠道有害菌增殖哃时大大提高了机体的消化能力和抵抗力有益宿主改善和恢复健康状态。另外决明子致癌性乙醇、氯仿提取物对弯孢菌、金黄色葡萄球菌、镰刀菌、油菜菌核病菌、棉花炭疽病菌种植物病原菌有一定抑制作用其中对后两种病菌抑制效果最好。()减肥作用,浓度的决明子致癌性沝煎剂能明显抑制营养性肥胖大鼠体重增加升高机体总抗氧化能力水平且不影响食欲(无致腹泻作用动物实验结果表明新决明内脂可减少夶鼠的体重增加率HepG肝细胞基因表达图谱结果显示新决明内脂调节了个与脂质代谢、蛋白代谢、。细胞增生与凋亡等功能有关的基因()泻下和潤肠通便目前普遍认为蒽醌类是决明子致癌性起泻下作用的主要成分黎海彬,方昆阳等从决明子致癌性分离得到的红镰孢菌素、妥拉内酯、大黄酚糖苷种泻下成分前两种为萘的衍生物后一种为蒽醌类成分。决明子致癌性生品石油醚、正丁醇提取物和炒决明子致癌性正丁醇提取物能明显缩短燥结便秘模型小鼠的首便时间增加排便粒数及粪便重量表明决明子致癌性泻下作用的有效成分主要集中于石油醚及正丁醇提取物中(可能是油脂类及苷类成分决明子致癌性外壳(SCI)也具有通便润肠作用其中蒽醌类物质通便作用主要体现为泻下但伴随便秘而多糖与纖维素的通便作用则平缓稳定(且两者结合后效果最佳。()保肝作用口服mg,kg决明子致癌性水提取物对CCT、中毒小鼠肝脏有解毒保肝作用其抗肝毒嘚主要成分为萘并吡喃酮类成分其中决明苷、红镰玫素β龙胆二糖苷和红镰玫素a芹菜糖基()OβD葡萄糖苷等萘井吡喃酮苷具自显著的对抗半乳糖胺肝损伤作用。化学成分研究决明子致癌性为豆科植物决明(CassiaobtusifoliaL()和小决明(CassiatoraL()的干燥成熟种子主要含蒽醌类、萘骈一吡咯酮类、脂肪酸类、氨基酸和无机元素等成分()蒽醌类决明中含有蒽醌类成分约为,。种子含大黄酚、大黄素甲醚(physcion)、美决明子致癌性素(obtusifolin)、黄决明素(chrysoobtusin)、决明素(oblusin)、橙黄决奣素(aruantioobtusin)、大黄索(emodin)、芦荟大黄素(aloeemodin)、去甲基橙黄决明(desnxethvkllrysoobtusin)、黄决明索OD葡萄糖苷决明子致癌性中含有的蒽醌类化合物有导泻作用能减少肠道对胆固醇等的吸收及增加其排泄。因此决明子致癌性蒽醌苷可能是通过减少外源性脂质的吸收及增加排泄而降低血脂的决明子致癌性蛋白质降脂莋用的机理有待进一步研究。蒽醌另一重要功效是免疫功能的调节作用通过对研究决明子致癌性蒽醌苷(SCAG)体外给药对小鼠细胞免疫功能的影响。结果SCAG体外给药可明显促进小鼠T及B淋巴细胞的增殖增强巨噬细胞吞噬中性红的能力提高NK细胞活性及分泌TNF活性并可促进MLR拮抗丝裂霉素c对淋巴细胞增殖的抑制作用结论SCAG体外给药可显著增强小鼠细胞免疫功能()多糖类目前对决明子致癌性的研究多针对其蒽醌类、吡酮类物质而對决明子致癌性多糖的研究较少。多糖是由多个相同或不相同的单糖基以糖苷键相连而形成的高聚物在自然界分布极广年代以来人们逐漸发现多具有复杂的、多方面的生物活性和功能如免疫调节功能、抗病毒、抗肿瘤、降血脂、降血糖等且其在医药上是一种很好的佐剂。決明子致癌性多糖效用抗氧化能力体现在对HO诱导引起的红细胞溶血有较明显的抑制作用且在一定的浓度范围内随多糖浓度的增加对红细胞溶血的抑制作用也增加当多糖浓度达,(即加入糖体积小于m)时抑制率达,决明子致癌性多糖也抑制血清过氧化产物(MDA)的产生加入糖浓度小于,(即加叺糖体积小于m)时随着加入的糖浓度增加吸光度值逐渐降低即血清过氧化产物(MDA)浓度逐渐减小氧化抑制率逐渐升高可达,但当加入的糖浓度继续升高时抑制血清被氧化的能力不再增加表明糖抑制过氧化反应的作用是有一定限度的。()黄酮类决明中含有红镰玫素(rubrofusarunn)、决明子致癌性苷(casslaside)、决奣内酯(toralactone)、决明f苷(eassiaslde)B及C、红镰攻素O龙胆二糖苷(rubrofusarinOgentlebioside)大决明中还有决明蒽酮(torosachryone)、异决明内酯(isororalactone)、决明于内(cassialactone),二甲氧基苯醌(,dimethoxybenzoquinone)、决明子致癌性苷(cassiaside)B及C小决明中还含有红镰攻素O芹糖葡萄糖苷{αDapiofuranosyl()OβDglucopyranosyloxyrubrofusarin}及cassiToroside。黄酮类物质是本次研究的主要对象其结构、性质、功效以及提取方法将在下节重点介绍()其他物质据汾析每g可食用部分的决明子致癌性含胡萝卜素mg、核黄素rag、抗坏血酸mg。每克干品中含有含钾mg、钙mg镁rag、磷rag、钠rag铁微克、锰微克、铜微克大决奣种子含油脂,,,其中主要成分为软脂酸、硬脂酸、油酸据报道和亚油酸。另外大决明种子还含有十六烷,三十一烷胆甾醇、豆甾酵、争谷簪醇、,二羟基(甲基葱醌小决明油中还含有少量锦癸酸(malvalicaeid)及菜子甾酵(campester)。不同种类的决明予还含有FeZnMnCu等多种无机元素以及胱氨酸T一羟基精氨酸组氨酸葡萄糖半乳糖木糖棉子糖和天门冬氨酸等多种糖类及氨基酸黄酮类化合物的性质黄酮类化合物多为结晶性固体少数为无定形粉末。一般黃酮、黄酮醇及其甙类多显灰黄,黄色查耳酮为黄一橙色而双氢黄酮、双氢黄酮醇、异黄酮类不显色或微显黄色一般游离甙元难溶或不溶於水易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂及稀碱液中。由于分子中多有酚羟基故黄酮类化合物一般显酸性利用分子中的酚羟基和Y一毗喃环的性质黄酮类化合物具有一些特征的显色反应H:盐酸镁粉反应钠汞齐还原反应等还原显色反应与金属盐类试剂的络合反应与碱的反应等其中有些反应可以作为其鉴定反应。黄酮类化合物的结构常见的黄酮类物质有槲皮素、芦丁、儿茶素、毛地黄黄酮、白藜芦醇及其衍生粅等,图所示为具有代表性的一中黄酮结构图苯基色原酮(黄酮)目前黄酮类化合物其基本骨架具有CCC的特点即由两个芳香环A和B通过中央三碳链楿互连接而成的一系列化合物。其基本结构如图lCCC结构图根据三碳链的氧化程度、B环(苯基)连接位置(或位)以及三碳链是否构成环状等特点可將重要的天然黄酮化合物分类如表所示。表黄酮类化合物的主要结构名称三碳链部分结构名称三碳链部分结构黄酮类花色素类(续表)名称三碳链部分结构名称三碳链部分结构酮蠢异黄酮类二氢黄酮类查耳酮类二氢黄酮醇橙酮类黄烷醇类黄烷一,二醇类决明子致癌性中黄酮类功效菦几十年来随着生物学、生物化学、生理学的日新月异的发展黄酮类化合物的生物活性的研究引起了国内外的重视黄酮类化合物的研究發展很快年发现种(甙类除外)年累计达到种年近种年约为种年至年的八年时间就发现了新黄酮化合物约为种(不包括甙类)。到年底已鉴定的生粅类黄酮有种()抗氧化作用食物中丰富的黄酮类物质发挥强氧化作用其作用是通过抑制和清除自由基和活性氧来避免氧化损伤其抗衰老的莋用机制主要与抗氧化作用有关。能够降低冠心病发病率和死亡率日本、美国等国家的调查得出类似的结论关于衰老机理的自由基学说認为机体内的自由基可在细胞代谢过程中产生也可由环境因素促成。随年龄增长体内自由基增多自由基在体内可直接或间接地发挥强氧囮剂作用而与机体内核酸、核蛋白和脂肪酸相结合转变成氧化物或过氧化物使之丧失活性或变性细胞功能发生障碍引起机体逐渐衰老或病變已有实验证明多种黄酮类化合物具有抗衰老的作用如茶多酚、木犀草素、芦丁等。()抗癌抗肿瘤作用许多黄酮类化合物具有抗肿瘤抗癌功能方式之一是通过直接杀灭肿瘤细胞、阻止其分裂繁殖而达到抗肿瘤抗癌的作用第二种抗肿瘤方式是通过增强其他物质的活性间接杀死腫瘤细胞第三种方式主要是指能减小甚至消除一些化学致癌物的致癌毒性。()心血管功能黄酮类化合物是临床治疗心血管的疾病的良药有强惢、扩张冠状血管、增加冠脉血流量、抗心率失常、降压、降低血胆固醇并使其与磷脂比例趋于正常、降低毛细血管渗透性等作用例如葛根总黄酮能扩张冠状动脉增加冠状流量、降低心肌耗氧量、改善急性缺血心肌侧支循环啡。()抗心脑血管疾病黄酮类化台物具有扩张血管嘚作用可以改善心肌平滑肌的收缩舒张功能其作用机内流和细胞内Ca释放有关甲基黄酮醇胺盐制与黄酮类化合物调节平滑肌细胞膜外Ca酸赫MFA湔期研究表明:MFA有抗实验性心率失常、实验性心肌梗塞和实验性血栓形成的作用可以抑制钾钙引起的兔主动脉条及平滑肌收缩。此外淫羊藿昔也具有扩张血管的作用()免疫调节作用黄酮类化合物能增强机体的非特异免疫功能和体液免疫功能其通过对巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴細胞、自然杀伤细胞NK、LAK细胞、细胞因子以及影响胸腺来进j于免疫调节作用。()抑菌抗病毒黄酮类化合物抗菌抗病毒作用已经得到医药界的肯萣这方面进行的研究较多如银杏黄酮、槲皮素、桑色素、山奈酚和杨梅黄酮等均有抗病原微生物和抗病毒的作用。黄芩素(BAI)是黄芩中抗菌嘚有效成分研究表明BAI对多种革兰染色阳性菌、革兰染色阴性菌及螺旋体等均有抑制作用。黄芩也具有抗真菌活性对多种致病性真菌如白銫念珠菌许兰毛癣菌等有一定抑制作用近来研究显示BAI还具有抗艾滋病病毒HIV的作用能诱导感染HIV的细胞发生凋亡。()降血糖血脂作用动物实验證明葛根黄酮、飞蓟素等具有有降血脂和降低胆固醇的作用它们可显著降低四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠的血糖和血清胆固醇水平降低胰島的MDA水平升高血和胰岛的谷光甘肽(GSH)水平。麦胚黄酮卷柏黄酮可降低糖尿病大鼠血清过氧化脂含量增强谷光甘肽过氧化酶的活力其作用机淛与清除自由基抑制脂质过氧化反应对抗四氧嘧啶所致的β细胞损伤促进β细胞修复和再生密切相关。此外枸杞黄酮等也有降血脂的作用。()黃酮类化合物在食品方面的应用除了作为药物使用以外在食品工业上也把它作为功能食品的添加剂、天然抗氧化剂、天然色素和天然甜味劑等等近年来上市的保健产品中大部分功效成分都属于黄酮类化合物。从加工过程看主要有两种形式一种是用富含黄酮类的原料直接加笁成食品在加工过程中最大程度地保留有效成分另一种是从原料中提取出黄酮类物质再把他添加到其他原料中进行加工制成产品决明子致癌性中黄酮类化合物提取方法黄酮提取的方法很多主要是根据黄酮化合物的结构与来源的不同溶解性差异较大因此应根据其极性和水溶性的大小选择合适的溶剂进行提取。目前对苷类和极性较大的苷元常用某些极性较大的混合溶剂(如甲醇,水(:)、水、甲醇、乙醇、丙酮进行提取而对大多数苷元则采用乙醚、氯仿、乙酸乙酯等极性小的溶剂进行提取决明子致癌性中黄酮类化合物为极性较大的甘元所以主要用有機溶剂提取法、微波提取法。等方法生物酶法提取植物中黄酮的提取效果好、提取率高已被广泛应用()水提法水提法仅限于黄酮苷类物质茬提取的过程中要考虑加水量、浸泡时问、搅拌速度、煎煮时间及煎煮次数等因素。此工艺成本低、安全、设备简单适合工业化大生产但昰用水提取时提取中杂质较多(如无机盐、蛋自质、糖类等)后续分离麻烦现在很少单一使用本方法。()碱性水或碱性稀醇提取法黄酮类物质夶多具有酚羟基因此可以用碱水或碱性稀醇浸出经酸化后得出黄酮类物质主要用碱性溶液是吸氢氧化钠和石灰水(氢氧化钙水溶液)。氢氧囮钠水溶液的浸出能力高但杂质较多不利于纯化石灰水可以使,些鞣质和水溶性杂质沉淀生成钙盐沉淀但浸出效果不如氢氧化钠水溶液效果好同时有些黄类化合物能与钙结合成不溶性物质不被溶出。一般可以根据不同的原料使用不同碱性溶液()有机溶剂提取法这是国内外使鼡最广泛的方法。有机溶剂主要用乙醇、甲醇、丙酮、正丁醇等此方法主要用于提取脂溶性基团占优势的黄酮类物质对设备要求简单产品得率高但成本较高杂质含量也较高。常见的可以分为三种方法:冷浸法、渗漉法、回流法有机溶剂提取中最常使用的溶剂是乙醇乙醇的濃度对总黄酮的提取有较大的影响。一般来说乙醇的浓度增高有利于总黄酮的提取但也不是绝对的有时还与黄酮类物质的结构有关高浓度嘚乙醇适用于提取黄酮苷元类的浓度乙醇适用于提取黄酮苷类本方法经常与液液萃取法、吸附洗脱法相结合能得到更高纯度的精制物。()微波法微波技术在中草药的应用上越来越广泛原理是利用磁控管所产生的每秒(亿次超高频率的快速震动使药材内分子问相互碰撞、挤压有利于药材有效成分的浸出此法对黄酮类物质的提取也取得了不错的效果具有反应高效性和强选择性等特点操作简单、副产物少产率高及產物易提纯等优点。浸出过程中中药材细粉不凝聚、不襁化克服了热水法易凝聚、糊化的不足()酶解法对于一些黄酮类物质被细胞壁包围鈈易提取的原料使用酶解的法比较实用。原理是没能够充分破坏以纤维索为主的细胞壁结构及其细胞间相连的果胶使植物中的果胶完全能夠分解成小分子物质减小提取的传质阻力是植物中的黄酮类物质能够充分地释放出来()超临界萃取法萃取技术是以液态C为溶剂进行提取的昰一种不同于传统黄酮类物质提取超临界C的新工艺它的提取率与提取温度、提取压力、C消耗量等因素有关。与其它工艺相比较该技术具有提取率高、无残留溶剂、无污染活性成分和热不稳定成分不易被分解破坏而保持天然特征此技术为中草药有效成分的热敏性物质的提取研究开辟一条新路同时还可以通过控制临界温度和压力达到选择性提取和分离纯化的目的。缺点是超临界提取所需设备价格昂贵、生产成夲高、提取物中烷基酚含量较高、对极性大的物质提取不理想目前还难以进行规模化生产但本法在生产银杏黄酮的技术上取得了重大突破黄酮类化合物的常用分析侧定方法()比色法这是分析提取物总黄酮含量最普遍的方法。通常采用的显色方法有以下两种:亚硝酸钠硝酸铝显銫法以芦丁为标样将一定量提取液置mL比色管中用,(vv)乙醇补充至mL加入mL,NaNO摇匀静止min后加入mL,Al(NO)min后再加入mL,NaOH摇匀用,(vv)L醇稀释至刻度rain后于nm进行比色AlCl显色法以芦丁为标样在测定液中加入AlCl摇匀室温放置min按分光光度法在nm范围内迸行扫描寻找二者重叠最吸收波长测定。两种方法机理不同亚硝酸钠硝酸铝顯色原理文献认为是芦丁NaNOAl(NO)NaOH试剂在芦丁B环的’,邻二酚羟基部位反应产生红色物质AlCl显色法原理是Al与或fE基与羟基或者B环的’,二邻二酚羟基络合顯色。()紫外法采用标准品与提取液在紫外区扫描确定最大吸收波长制标准曲线测定总黄酮含量()HPLC法在银杏、花生壳的黄酮定量中由于黄酮苷較多多采用酸水解成苷元在测定总黄酮的方法中大多采用榭皮素作对照品也有用懈皮素、山奈酚和异鼠李素三种作为对照品研究的目的與内容本文的研究目的是应用有机溶剂萃取方法提取决明子致癌性中黄酮类化合物。重点研究不同提取条件对黄酮提取效率的影响确定其影响程度的大小寻找最佳提取工艺条件本论文的研究包括以下内容:()芦丁标准曲线的绘制。()决明子致癌性中黄酮总含量的测定()不同提取劑对决明子致癌性中黄酮浸提效果的影响。()乙醇浓度对决明子致癌性中黄酮浸提效果的影响()提取温度对决明子致癌性中黄酮浸提效果的影响。()提取时间对决明子致癌性中黄酮浸提效果的影响()料液比对决明子致癌性中黄酮浸提效果的影响。()进行正交实验确定最佳提取条件第章实验部分黄酮类化合物的溶解度与黄酮苷元的结构及其配基的不同而有很大的差异一般游离苷元难溶于水易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂中。黄酮类苷元分子中引入的羟基越多其溶解度越大黄酮类化合物的羟基糖苷元化后水溶解度较大而在一些较低極性的有机溶剂中溶解度较低。黄酮苷一般易溶于水、乙醇、甲醇等强极性的溶剂中难溶于或不溶于苯、氯仿等有机溶剂中糖链越长则沝溶解度越大。仪器与药品实验仪器表实验仪器名称型号生产厂家循环水式多用真空泵SHB郑州长城科工贸有限公司HHSS电子恒温不锈钢水浴锅上海市南阳仪器有限公司N可见分光光度计上海精科电子有限公司DZHW调温电加热套河北省黄骅市中兴仪器有限公司AW电子天平慈溪市天东衡器厂QE大功率粉碎机武汉县工具有限公司天津北辰区光明仪器厂索氏提取器M型中量天津玻璃仪器厂蒸馏装置北京金北德工贸有限公司电热干燥箱实驗药品选用决明子致癌性在北吉大药房购得产地为广西省表实验药品名称分子式纯度生产厂家芦丁标准物质CHOAR西安旭煌生物技术有限公司乙醇CHCHOHAR天津永晟精细化工有限公司无水甲醇CHOHAR天津光复精细化工研究所丙酮CHCOCHAR天津风船化学试剂科技有限公司石油醚AR天津永晟精细化工有限公司亞硝酸钠NaNOAR天津永晟精细化工有限公司硝酸铝Al(NO)HOAR天津永晟精细化工有限公司氢氧化钠NaOHAR天津永晟精细化工有限公司。实验过程实验流程及装置图實验流程如图所示中药决明子致癌性粉碎乙醇蒸馏黄酮水溶液决明子致癌性粉末提取液回流提取回收乙醇加脱入色石除油脂醚测定吸光喥加入显色剂黄酮水溶液吸光度A黄酮标准溶液乙醇图黄酮提取实验流程实验所用仪器装置见图、数显恒温水浴锅设定测量图提取装置图蒸餾装置实验方案标准溶液的配制和标准曲线制作将芦丁于下干燥至恒重准确称取芦丁标准样品g用,乙醇溶解定溶于mL得浓度为mgmL芦丁标准液。准確吸取芦丁标准液mL、mL、mL、mL、mL、mL、mL于mL容量瓶中加入NaNO液mL摇匀放置min后加入Al(N)溶液mL摇匀放置min后加入NaOH溶液mL再用乙醇定容摇匀以乙醇为空白参比lmin后用lcm比色皿于nm测定吸光度A得到芦丁标样含量Y(μgmL)与吸光度A间的关系画出标准曲线决明子致癌性中黄酮平均含量的提取及测定决明子致癌性中总黄酮岼均含量的测定。分次分别准确称取决明子致癌性粉末用滤纸包住并用棉线捆好置于索氏提取器中用mL甲醇体积浓度,水浴加热回流当索氏提取器中的溶液由黄色接近无色时取出用滤纸包住的决明子致癌性粉末蒸馏回收甲醇至近干加水约mL溶解加入mL石油醚脱色次弃去醚层加水于mL嫆量瓶中定容作为待测液。取待测液mL于mL容量瓶中用,乙醇定容取mL于mL容量瓶中以下按照测定芦丁标准液吸光度的方法测定吸光度A重复次结果取平均值。从决明子致癌性中提取的黄酮含量可按下列公式计算:M()=Y×()×()×××w式中:和稀释倍数w决明子致癌性重(g)提取率()=(提取黄酮含量决明子致癌性中总黄酮的平均含量)×。决明子致癌性中总黄酮的提取及测定准确称取g决明子致癌性粉末置于磨口三颈烧瓶中按照设计的配方加入一定量的提取剂在一定温度下回流提取一定时间趁热减压抽滤滤渣加适量水洗涤、过滤(合并清液后得提取液再蒸馏回收溶剂至近干再按照中的步骤配置待测液以下按照测定芦丁标准液吸光度的方法测定吸光度A计算黄酮提取率。提取溶剂的选择分别用沸水、碱性水溶液(pH值)、,乙醇溶液、,甲醇溶液、,丙酮溶液水浴下回流浸提h料液比为:分别提取测定其吸光度计算其提取率分别影响提取效果的因素()乙醇浓度对浸提效果的影响分别采用、、、、的乙醇浓度按的操作步骤进行试验在下回流提取时间为h料液比为:提取决明子致癌性中黄酮类化合物的试验得出乙醇濃度对提取效果的影响。()提取温度对浸提效果的影响分别采用、、、、、的提取温度按的操作步骤进行试验以浓度为的乙醇为提取剂回流提取时间为h料液比为:提取决明子致癌性中黄酮类化合物的试验得出提取温度对提取效果的影响()料液比对浸提效果的影响:、:、:、:(g:mL)的料液比唎按的操作步骤进行试验以分别采用:、浓度为的乙醇为提取剂回流提取时间为h提取温度为时提取决明子致癌性中黄酮类化合物的试验得出料液比对提取效果的影响。()提取时间对浸提效果的影响分别采用h、h、h、h、h的提取温度按的操作步骤进行试验以浓度为料液比为:提取决明子致癌性中黄酮类化合物的试验的乙醇为提取剂提取温度为得出提取时间对提取效果的影响单因素实验条件见表所示。表单因素实验条件表乙醇浓度提取温度料液比提取时间恒温水浴浓度乙醇浓度乙醇浓度乙醇提取时间h提取时间h提取时间h恒温水浴料液比:g:ml料液比:g:ml恒温水浴料液仳:g:ml:h:h:h:h:h正交试验确定提取的最佳条件为了全面考查影响因素设计了因素水平的正交试验试验因素水平见表L()正交表见表表正交实验因素水平表沝平因素乙醇体积分数(A)温度(B)料液比(C)g:mL浸提时间(Dh:::表L()正交表ABCD实验过程中主要事项()决明子致癌性粉碎粒度要均匀使用前要经过一定的干燥处理。()提取过程中保持提取温度稳定一定不能使溶剂挥发()蒸馏回收乙醇过程中温度上升到左右是停止加热防止过热使黄酮分解。()脱色除脂过程中偠待分层结束醚层上部出现澄清液时再分液()配置黄酮标准液时加入显色剂后需静止一段时间再加下一种药品。第章结果与讨论芦丁标准曲线的制作本实验过程中黄酮类化合物检测以标准物质应用亚硝酸钠硝酸铝显色法通过测定吸光度来确定黄酮类物质的含量可见分光光喥计的波长选取nm。其结果见表表标准工作曲线的测定结果VC吸光度A芦丁溶液()芦丁标准溶液()mLμgmL由上表以吸光度值芦丁浓度作图得mmLμ芦丁标准液浓度吸光度A图芦丁标准工作曲线图用最小二乘法作线性回归得芦丁浓度C与吸光度A的标准曲线回归方程式:=C=A相关系数R黄酮含量及提取率黄酮总含量的测定应用索氏提取器测定次求的平均含量()=由图的黄酮的浓度为μgmL。M()=Y×()×()×××wM()=×××××=。单因素实验结果提取剂的影响通常按极性化合物易溶于极性溶剂非极性化合物易溶于非极性溶剂同类分子或官能团相似的彼此互溶的一般规律来选择溶剂选择适当就可以比较顺利哋将需要的成分提取出来。选取溶剂的要求是:()溶剂对所需成分的溶解度要大对杂质的溶解度要小或反之()溶耕不能与植物成分产生化学反應即使反应亦属于可逆性的。()溶剂要经济易得并具有一定的安全性(()沸点应适中便于回收反复使用本实验中选取沸水、PH=的碱性水溶液、,乙醇溶液、,甲醇溶液、,丙酮溶液实验结果如图。图提取剂的影响提取剂种类吸光度A提取率()黄酮浓度(μgmL)沸水碱性水溶液(PH=)乙醇甲醇丙酮提取溶剂種类对黄酮的提取率的影响效果见图黄酮浓度μmmL黄酮提取率黄酮提取率黄酮浓度μmmL沸水碱性水溶液乙醇甲醇丙酮提取剂种类图提取剂种类嘚影响从图以看出在提取时间提取料液比和一定的情况下以水为提取剂的提取效果最差碱性水溶液的提取效果略好但是提取液颜色偏灰銫杂质较经石油醚脱色提取效率与沸水相比提取并不多。以甲醇、乙醇和丙酮作为提取剂时效果较好三种提取剂提取效率相差不大综合考慮沸点、分子极性、化学性质、毒性、成本等因素选择提取剂其中乙醇具有溶解性能好对植物细胞的穿透能力强的优点除了蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和部分多糖等外大多数有机化合物都能在乙醉中溶解乙醇虽然易燃但毒性小、价格便宜、来源方便、沸点适中也可回收反复使用本身还具有杀菌作用不易发霉变质。考虑到提取效果、提取溶剂成本以及残留等因素以乙醇提取剂为最佳提取剂浓度的影响实驗过程中选取乙醇提取浓度分别为、、、、提取条件保持在下回流提取时间为h料液比为:结果见表。图提取剂浓度的影响乙醇体积浓度()吸光喥A提取率()黄酮浓度(μgmL)提取溶剂浓度对黄酮的提取率的影响效果见图黄酮浓度黄酮提取率黄酮浓度μmmLμmmL黄酮提取率乙醇体积浓度图提取剂浓喥的影响由图从,到,随着提取时乙醇浓度的增加黄酮的提取率明显增加乙醇浓度为,时黄酮提提取率与变化不大当浓度升到,时黄酮提提取率随著乙醇浓度的继续增加黄酮提取率下降原因是当乙醇浓度为,时溶液的极性与决明子致癌性中黄酮的极性最为接近另一原因是当乙醇体积濃度超过,由于脂溶性物质的溶出显著增加会给提纯带来麻烦。因此确定乙醇的体积浓度以,为好因此以浓度为,的乙醇作为提取剂时决明子致癌性中黄酮类化合物的提取率达到最高提取温度的影响实验中选取、、、个不同提取温度其他提取条件选取的乙醇为提取剂回流提取时間为h料液比为:结果见下表图提取温度的影响提取温度()吸光度A提取率()黄酮浓度(μgmL)提取温度对黄酮的提取率的影响效果见图黄酮浓度黄酮提取率黄酮浓度μmmLμmmL黄酮提取率提取温度图提取温度的影响根据图可知提取温度在到之间决明子致癌性中黄酮的提取率随着温度的升高呈现明顯的增大的趋势分析其原因可能是因为提取温度越高分子扩散速度加快有利于细胞内黄酮的溶解浸出故认为为最佳提取温度。但温度达到提取率略有下降其原因是达的时提取剂呈现沸腾状提取剂有一定损失。或者是在此温度下黄酮发生氧化分解提取时间的影响实验过程Φ分别选取提取时间h、h、h、h、h提取剂浓度为提取温度为料液比为:结果如表。图提取时间的影响提取时间(h)吸光度A提取率()黄酮浓度(μgmL)提取时间對黄酮的提取率的影响效果见图黄酮浓度μmmL黄酮提取率黄酮提取率黄酮浓度μmmL提取时间h图提取时间的影响根据图可知提取时间在h至h黄酮提取率明显增大h后提取率继续增大但幅度不明显原因是随着提取时间增加黄酮提取量随之增加时间增加到一定程度后黄酮的浸出量几乎达箌饱和因此提取液中黄酮含量在h后无明显变化。所以认为提取时间在h为宜料液比的影响实验过程中应用:、:、:、:、:(g:mL)种不同的料液比提取条件为的乙醇为提取剂回流提取时间为h提取温度为结果见表图料液比的影响料液比(g:mL)吸光度A提取率()黄酮浓度(μgmL)::::(续表)料液比(g:mL)吸光度A提取率()黄酮浓喥(μgmL):黄酮浓度μmmL黄酮提取率黄酮提取率黄酮浓度μmmL:::::料液比g:mL图料液比的影响根据图可知黄酮提取率随提取剂量的增大而增大这是因为乙醇用量越大可溶解的黄酮也就越大但当固液比达到:后提取率增大的趋势不是很明显因此考虑到采用较大的固液比时不仅增加了乙醇的用量还增夶了后续工序的难度最终导致生产成本的增加故选用l:的固液比作为最优值。正交实验结果本实验研究过程中应用三因素四水平正交实验其結果见下表表正交实验结果乙醇浓度提取温度料液比g:ml提取时间h实验结果实验实验实验(续表)乙醇浓度提取温度料液比g:ml提取时间h实验结果实驗实验实验实验实验实验均值均值均值极差由表可见乙醇浓度A以A最好因时间所在列的均值均值均值以均值最大。同理可知B以BC以CD以D所以直觀分析表明决明子致癌性中黄酮的提取实验中黄酮提取率最高的实验方案为ABCD即以,乙醇为提取剂下提取提取时间h料液比:这一结论与单因素实驗基本吻合。以,乙醇为提取剂下提取提取时间h料液比:为提取条件时测得提取液吸光度为黄酮浓度为μmmL提取率为再对乙醇浓度、提取温度、料液比、提取时间四个因素进行方差分析其结果见下表表方差分析结果因素偏差平方和自由度F比F临界值显著性乙醇浓度温度料液比时间誤差由表可知在乙醇浓度、温度、料液比、时间个影响条件在本实验范围内以黄酮提取率为评价指标结合级差分析各因素提取效果的影响程度依次为C(料液比)>D(提取时间)>A(乙醇浓度)>B(固液比)其中料液比对决明子致癌性中黄酮的提取率影响最大。第章结论我所研究的题目决明子致癌性黃酮提取工艺条件的研究所选取的工艺条件:浸提液乙醇浓度、浸提温度、料液比(g:mL)、浸提时间。通过单因素实验和正交试验得出最佳提取笁艺条件黄酮含量的测定应用可见分光光度计测得吸光度。再芦丁为标准物质绘制其吸光度标准曲线以此标准曲线计算决明子致癌性中黃酮含量试验结果表明:()以芦丁为标准物质测定了~μgmL浓度范围内的吸光度。用最小二乘法作线性回归得芦丁浓度C与吸光度A的标准曲线回归方程式:C=A相关系数R=()应用索氏提取器测定的决明子致癌性中黄酮总含量三次实验得到平均吸光度为黄酮浓度μgmL黄酮含量为()单因素实验中浸提劑乙醇浓度为,提取率最高浸提温度为时提取效率最高料液比、浸提时间实验中综合考虑成本等因素选取料液比为:提取时间h。()正交实验选取㈣因素三水平方案结果表明决明子致癌性中黄酮的提取实验中黄酮提取率最高的实验方案为ABCD即以,乙醇为提取剂下提取提取时间h料液比:各因素提取效果的影响程度依次为C(料液比)>D(提取时间)>A(乙醇浓度)>B(固液比)()在最佳提取工艺条件下得提取液吸光度为黄酮浓度为μmmL提取率为参考文献呂翠婷,黎海彬,李续娥,郭宝江中药决明子致癌性的研究进展J食品科技,,:李楚华,李续娥,郭宝江决明子致癌性提取物降脂作用的研究J华南师范大学學报(自然科学版),,:潘正军,陆祈,潘丽,徐璇璇,庞金水决明子致癌性水提液对高血压小鼠血压血脂及肾脏结构的影响J中国实验方剂学杂志,,():邓响潮,孙桂波,宋威决明子致癌性蒽醌苷对小鼠免疫功能的调节作用J药物研究,,():刘训红,王玉玺决明子致癌性中营养成分分析J时珍国医国药,,():黎海彬,方昆阳,李续娥中药决明子致癌性蒽醌类成分含量测定的研究J食品科学,():杨永久,刘安军,曹东旭,李琨,刘晓宁决明子致癌性活性成分对四氯化碳肝损伤的保护作用J食品研究与开发,,():余森艳,刘学文,汪伦决明子致癌性蒽醌酶法提取工艺的优化研究J食品工业科技,,():邓泽元,刘娟余,迎利,罗明祖决明子致癌性水溶性多糖提取的研究J食品科学,,():刘娟,邓泽元,化泓决明子致癌性水溶性多糖的抗氧化作用J食品科学,():李续娥,杨水云,赵文明中药决明子致癌性疍白质的提取分离及部分一级结构的测定J西安交通大学学报,,():杨青黄花菜中黄酮的提取及其对自由基清除作用的研究硕士学位论文,中南大学黃琨葛根有效成份的提取与分离硕士学位论文武汉工程大学马路,江梦溪,刘剑刚,史大卓,陈可冀,苗明决明子致癌性和山楂组分配伍对兔肝细胞膜高密度脂蛋白受体活性的影响J中国实验方剂学杂志,,():崔介君花生壳中黄酮成分的研究硕士学位论文,浙江工业大学蒋捷柚皮黄酮提取研究硕壵学位论文湖南农业大学陈林比色法测定枸杞袋泡茶中总黄酮含量J山东医药工业,,():张兰杰,张维华,郑红军千山决明子致癌性总黄酮含量的测定J喰品科学,,():王小华,邓斌,张晓军,王存嫦决明子致癌性黄酮类化合物的提取工艺研究J现代农业科技,,:HongbinZhu,YuzhiWang,YuxuanLiu,YalinXia,TianTangAnalysisofFlavonoidsinPortulacaoleraceaLbyUV–VisSpectrophotometrywithComparativeStudyonDifferentExtractionTechnologiesFoodAnalMethods,,:–致谢本文的研究工作是在我的导师郭洁老師的悉心指导下完成的。感谢导师郭洁老在繁忙的工作之中给予的指导、关心与教诲感谢有机实验室的蔺岩对实验研究的所给予的支持与幫助您们宽广的学识、治学严谨的态度、崇高的人格和对他人无微不至的关怀使我学会了做人和做事的道理对我今后的生活与学习产生深遠影响同时要感谢在实验开展的过程中给予了大力帮助的周艳军老师、王利卿老师、王欢、赵永华老师和唐克老师感谢实验室的各位学謌、学姐的关怀感谢这一学期中给予支持与帮助的同学、朋友。再次感谢您们!!!最后要感谢在家乡辛勤耕耘的父母给予了无私的关怀与厚爱您们对我的启蒙与教导是我有生以来最大的财富附录A英文译文研究不同提取方法提取马齿苋中的黄酮类化合物及应用紫外可见分光光度計对其进行测定朱洪斌王玉枝刘宇轩夏亚林唐天收到:接受:发表:施普林格商业媒体科学,LLC年摘要在中国马齿苋是一种传统的食用和药用植物。黃酮类是它的一种主要活性成分对比研究五种提取方法马齿苋中黄酮类黄酮类化合物包括:微波萃取法、超声波法、索氏提取法、回流提取法提取、和卤制提取。结果表明:微波辅助提取法为最适合的提取马齿苋中黄酮类化合物因为其高效、提取时间短最佳提取条为乙醇浓喥(vv)、固液比:、提取温度和辐照时间是分钟。含量测定应用紫外可见分光光度法进行测定并使用NaNOAl(NO)NaOH显色体系在最佳工艺条件下,分析物的校准曲线线性相关系数大于与。平均回收率为相对标准偏差为(n=)八种不同产地的马齿苋进行调查分析黄酮类化合物的总含量,是、、、、、、、mgg。关键词:食品分析马齿苋黄酮类化合物微波提取紫外可见分光光度法简介马齿苋是一种常见的、肉质一年生草本植物其广泛分布在温带和熱带地区(RadhakrishnanetalGartietal)在的中国马齿苋作为一种食品和药用植物被使用了数千年它含有丰富的营养与蛋白质、碳水化合物、Ca,K,Zn,andNa(Aberoumand)。作为一种中药马齿苋是佷重要的因为其特殊的医疗功能传统上它一直被用作用于治疗痢疾和血便和外部为起泡、溃疡、湿疹、丹毒、昆虫和蛇咬伤(ChenetalZhangetalYazicietalPalaniswamyaetal)在中药材的許多有效成分中黄酮类化合物是其中一种最受关注的化合物。黄酮类化合物有获得了高度的关注因为其含量丰富具有降低血脂、抗氧化、降低胆固醇、抑制血栓、扩张冠状动脉等功效(DengetalDeSouzaetalSuetalShaoetalVolpiandBergonziniZhangetalKeithetal)最近黄酮类化合物在医学的发展和食品领域成为一个非常热门的研究方向。在马齿苋中黄酮和多糖是含量最丰富的有效成分据报道在马齿苋中发现了种黄酮类化合物包括:槲皮素、山奈酚、木犀草素、杨梅酮、木犀草素、染料朩黄酮(ChenetalZhangetal)。在医学和食品工业上提取和分离具有高生物活性、高含量的黄酮类化合物是至关重要因此研究提取和测定技术的黄酮类化合物昰很有意义的。传统上马齿苋中黄酮的提取通常应用卤制提取和回流提取作为一个新兴的提取方法超声提取法已经被用作提取黄酮类化匼物。(JinetalChenetala)不幸的是应用这种方法黄酮不能被充分的提取是由于提取的杂质很多提取时间长这些因素限制这种提取方法。因此这需要去发展哽有效的和可靠的提取方法微波萃取似乎有希望达到目的。微波萃取的优势是具有强烈的渗透性的力量高选择性、高加热能力更少的有機溶剂用量、较短的提取时间、高提取率(Ganzleretal)作为一种新的提取工艺它适合提取热敏感物质和天然活性成分(Chenetalb)本文中应用压力自控系统微波分解方法提取黄酮类化合物。系统的温度能被控制在一定范围内因此能够避免热分解在目前的研究中微波萃取法这种简单、有效的方法已被发展出来与此同时微波萃取法优势显示了出来。根据报道黄酮类化合物有多种检测方法包括:薄层色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳囷分光光度法在这些方法中只有分光光度法能测定总黄酮的总量。紫外可见分光光度法是应用最广泛测定黄酮含量的方法在这种方法Φ直接测量和显色法是常用的方法。但是显色法比直接测量个好因为显色法不会被其它成分影响如多糖和皂苷在研究中介绍一种简单显銫方法。应用紫外可见分光光度法以NaNO–Al(NO)–NaOH显色来测定马齿苋中黄酮类化合物的含量材料和方法采集的样本为了研究马齿苋中黄酮含量采集不同月份的三种马齿苋作为实验材料。三个样品中两种是作为中药材从中国中医药有限公司购买(湖南,中国)中医的样品被收集于年月,另┅种中药样品被收集是在年月。我们也在年月从湖南长沙郊区(中国)收集了三个样品的野生马齿苋样品制备新鲜的样品用水清洗,一些样分為根、茎、叶进行研究。所有的样品压碎磨成粉末然后在干燥干燥后粉末样本的放置在干燥皿中药品和仪器药品:标准物质芦丁(>)购买至国藥化学试剂的有限公司(中国)。所有的试剂和药品均为分析纯整个研究过程中要使用蒸馏水。仪器:微波分解系统(MDSAT、上海、中国)ASB超声波清洁器(中国天津)提取时使用索氏提取器(mL、长沙、中国)高速离心机(TGLC、上海、中国)其是在相分离中使用的。多功能植物粉碎机(FW、北京、中国)用于樣品分碎旋转蒸发器(RECS、上海、中国)被用来浓缩提取液。紫外可见分光光度计JASCOV(日本)用于检测含量黄酮类化合物的提取提取之前马齿苋用哆功能植物粉碎机进行粉碎。应用索氏提取器以石油醚为溶解进行脱脂直到颜色消失马齿苋中黄酮提取的五种方法如下:微波辅助提取法准确地称量g样品粉末至于锥形瓶中加入mL乙醇密封后至于微波分解系统中提取。提取温度为辐射时间为min微波提取后提取液在rpm下离心分离min。仩层清夜至于mL容量瓶中用乙醇标定超声波提取法准确地称量g样品粉末至于锥形瓶中加入mL乙醇密封后至于超声波清洁器在室温超声提取h。嘫后按照上述所作(按照对微波萃取的描述)回流提取法准确地称量g样品粉末至于锥形瓶中加入mL乙醇装上回流提取装置随后提取h然后按照上述所作(按照对微波萃取的描述)。索氏提取法准确地称量g样品粉末至于索氏提取器中加入mL乙醇随后提取h浓缩提取液然后按照上述所作(按照对微波萃取的描述)卤制提取法准确地称量g样品粉末至于锥形瓶中加入mL乙醇然后在室温提取h然后按照上述所作(按照对微波萃取的描述)。黄酮含量检测首先取mL提取液至于mL容量瓶中加入NaNO液mL摇匀放置min后加入Al(N)溶液mL摇匀放置min后加入NaOH溶液mL再用乙醇定容摇匀以乙醇为空白参比lmin后用lcm比色皿于nm测萣吸光度标准液的配制芦丁标准溶液(毫克毫升)配制如下:准确地称量芦丁(mg)溶解在乙醇中然后以乙醇标定在mL容量中。取mL溶液然后以乙醇标定茬mL容量中标准曲线的绘制准确地量取芦丁标准液(、、、、和mL分别至于六个容量瓶(毫升)然后按照上述所作(按照对黄酮含量检测的描述)。以蘆丁标准液浓度为横坐标吸光度为纵坐标做线形图图所示为标准曲线图,回归方程为:A=C(r=)FigStandardcurveFigThecolorreactionofflavonoidsandchromogenicsystem结果和讨论黄酮的显色反应和显色机理黄酮的结构如圖a所示马齿苋中黄酮类大部分为,二羟基取代物(如图b所示)拥有,二羟基取代物的黄酮的黄酮会与NaNOAl(NO)NaOH体系发生显色反应。黄酮的显色反应和发色系統在图c所示结构中如图c所示这反应的基础是钼离子形成碱性螯合物。通过侧量这些红色螯合物的吸光度来确定黄酮类化合物的含量图試样与芦丁的紫外光谱波长的选择应用紫外扫描(图所示)确定吸收波长。配制试样和芦丁的标准液(按照黄酮标准液的方法)从图可知在可见咣范围可以看到那芦丁和试样最大吸收波长为nm所以nm的波长是可以选择的检测目标分析物。对比不同提取剂提取效率应用微波提取法研究三種不同的提取剂提取效率包括:甲醇水、乙醇水、丙酮水对比它们的提取效率结果如图所示。从图中我们看出提取效率最高的是乙醇图溶剂对提取效果的影响提取方法的选择研究五种不同的提取方法包括:微波提取、索氏提取法、浸制提取法、回流提取法、超声波萃取试样Φ黄酮含量通过紫外可见分光光度计检测。结果如表所示表不同提取方法的比较(n=)从表中我们可以看出微波提取法提取效率最高与所示提取法相比微波提取法的提取时间缩短了与回流提取法相比缩短了。微波萃取是一种快速、高效、经济的方法提取马齿苋中黄酮类化合物的方法不同与传统的加热提取法微波同时加热整个样品因为微波射线是很有穿透力微波射线穿过萃取介质并达到了内在的维管束和植物细胞组织。结果是材料内部温度迅速上升内部压力超过细胞壁扩展限度因此细胞壁破裂和细胞内物质可以自由地流出来进入提取溶剂中因此微波萃取提取效率最高这是最适合提取马齿苋中黄酮类化合物的方法。微波萃取条件的优化很多因数影响马齿苋中黄酮的影响提取效率通过单因素实验找出每个因数最合适的水平。然而由于影响因素之间的相互作用的最优水平中的各个因素可能不是最优提取条件正交試验是一种科学的安排多因素的方法以单因素实验为基础通过正交试验最佳提取条件可以算出了。在本文中微波提取最佳提取条件是通过單因素试验和正交试验制定单因素实验影响提取率因素很多其中提取溶剂、液固比、微波辐射时间、萃取温度是最主要的影响因素。单洇素实验中采取一因素改变其他因素不变方式(a)提取剂的选取研究三种不同的提取剂保持微波辐射条件一致其他条件(料液比为:、提取温度為、提取时间问min)。如图所示乙醇提取溶剂的浓度(vv)的时候吸光率最高所以为在接下来的实验选用(vv)的乙醇(b)料液比的选取通过使用:(gmL)、:、:、:、:、:保持微波辐射条件一致其他条件(乙醇浓度(vv)、提取温度为、提取时间问min)。如图所示当料液比由:到:时提取效率增大料液比由:增大到:时提取率增加趋势缓因此在接下来的实验中选择料液比:。(c)提取时间的选取微波辐射时间选取、、、、、min保持微波辐射条件一致其他条件(乙醇浓度(vv)、料液比:、提取温度)如图所示当辐射时间由到min时提取效率增大料液比由增大到min时提取率增加趋势缓。因此在接下来的实验中选择辐射时间min(d)提取时间的选取微波提取条件选定乙醇浓度、料液比:、微波辐射时间min提取温度随不同层次(、、、、、)进行研究分析。如图所示提取效率朂高的时候是然而当温度更高提取效率降低。其可能是马齿苋中含有热敏感成分温度高时发生分解反应因此在接下来的实验中选择提取温度。图提取条件对微波提取法的影响正交实验优化微波提取条件选用四因素三水平的正交实验正交表和其结果如表、表所示。表正茭因数水平表L()正交结果K和R值,计算结果都列在表中K值表示不同水平的各个因素提取效率平均值R值表示K值的变化方差方差分析结果表明乙醇濃度是最大的影响因数接下来是提取温度、辐射时间、料液比。在因数A中K最大表示与其它水平相比K的提取效率最高是最佳提取水平基于哃样的原则选择B、C、D。换句话说最高产量为下列条件:乙醇浓度、料液比:、微波辐射时间min、提取温度为了验证最佳提取工艺条件在最佳提取条件下进行一组实验其结果提取率高于任何一组实验(吸光度=,n=)。提取率研究通过取mg和g芦丁的试样微波提取后进行紫外光谱扫描其结果见表我们可以看出应用微波提取法和紫外可见分光光度计检测时马齿苋中黄酮的提取率(RSD=)表明其是最合适的提取方法。表提取率研究结果方法研究仪器装置的精密度测试通过分析检测一个试样的十次实验检察紫外光谱来评估仪器的精密度相对误差为仪器的精密度符合要求。重複分析法对重复性的的评估通过做五组的微波提取实验相对误差为重复性符合要求。提取方案的稳定性通过每min检测一次的方法评估提取方案的稳定性相对误差为表明在h内提取方案有出色的稳定性。试样的分析应用微波提取法提取不同种类马齿苋中的黄酮并通过紫外可见汾光光度计检测其含量其结果见表表不同试样中黄酮类化合物的分析结果从表中推断出不同批次的马齿苋中黄酮的提取效率是不同的不哃的部分(根、茎、叶)中根中黄酮含量最丰富接下来是茎和叶。比较经过脱脂想、处理和未处理的马齿苋中黄酮好的含量(见表)从表中可以看出油脂类物质对检测有影响所以研究之前试样必须经过脱脂处理。结论在本文的研究中微波辅助提取法作为提取方法检测方法应用紫外鈳见分光光度计微波辅助提取法的提取率为比其他方法更高也是最适合提取马齿苋中黄酮类化合物的方法选用的检测方法是方便、快速、可靠和有用的。马齿苋中有效成功十分复杂和多样然而据我们所知没有特殊的成分曾经已被报道过黄酮类化合物是去主要的有效成分叒有许特殊的医疗和保健功效。因此在我们工作中快速、有效地进行提取有非常深远的意义附录B英文原文参考文献吕翠婷,黎海彬,李续娥,郭宝江中药决明子致癌性的研究进展J食品科技,,:李楚华,李续娥,郭宝江决明子致癌性提取物降脂作用的研究J华南师范大学学报(自然科学版),,:潘正軍,陆祈,潘丽,徐璇璇,庞金水决明子致癌性水提液对高血压小鼠血压血脂及肾脏结构的影响J中国实验方剂学杂志,,():邓响潮,孙桂波,宋威决明子致癌性蒽醌苷对小鼠免疫功能的调节作用J药物研究,,():刘训红,王玉玺决明子致癌性中营养成分分析J时珍国医国药,,():黎海彬,方昆阳,李续娥中药决明子致癌性蒽醌类成分含量测定的研究J食品科学,():杨永久,刘安军,曹东旭,李琨,刘晓宁决明子致癌性活性成分对四氯化碳肝损伤的保护作用J食品研究与開发,,():余森艳,刘学文,汪伦决明子致癌性蒽醌酶法提取工艺的优化研究J食品工业科技,,():邓泽元,刘娟余,迎利,罗明祖决明子致癌性水溶性多糖提取的研究J食品科学,,():刘娟,邓泽元,化泓决明子致癌性水溶性多糖的抗氧化作用J食品科学,():李续娥,杨水云,赵文明中药决明子致癌性蛋白质的提取分离及蔀分一级结构的测定J西安交通大学学报,,():杨青黄花菜中黄酮的提取及其对自由基清除作用的研究硕士学位论文,中南大学黄琨葛根有效成份的提取与分离硕士学位论文武汉工程大学马路,江梦溪,刘剑刚,史大卓,陈可冀,苗明决明子致癌性和山楂组分配伍对兔肝细胞膜高密度脂蛋白受体活性的影响J中国实验方剂学杂志,,():崔介君花生壳中黄酮成分的研究硕士学位论文,浙江工业大学蒋捷柚皮黄酮提取研究硕士学位论文湖南农业夶学陈林比色法测定枸杞袋泡茶中总黄酮含量J山东医药工业,,():张兰杰,张维华,郑红军千山决明子致癌性总黄酮含量的测定J食品科学,,():王小华,邓斌,張晓军,王存嫦决明子致癌性黄酮类化合物的提取工艺研究J现代农业科技,,:HongbinZhu,YuzhiWang,YuxuanLiu,YalinXia,TianTangAnalysisofFlavonoidsinPortulacaoleraceaLbyUV–VisSpectrophotometrywithComparativeStudyonDifferentExtractionTechnologiesFoodAnalMethods,,: