根据35U.S.C.§119(e)本申请要求2016年10月19日提交嘚美国临时申请号62/410,282的优先权，该临时申请的全部内容通过引用纳入本文
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治疗癌症的免疫疗法试图诱导、刺激和/或去抑制免疫应答以攻击和破坏异常增殖的细胞免疫疗法的策略包括使用免疫激活细胞因子、激活抗原呈递细胞(例如树突细胞)、过继细胞转移、靶向抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、免疫检查点抑制剂和它们的组合。
基于细胞因子的免疫疗法涉及使用激活免疫系统的各种武器以激发有效免疫应答的细胞因子在这种形式的免疫疗法中，细胞因子直接施鼡于对象或离体使用以活化分离的免疫系统细胞然后将其输注回对象(参见，例如Antony等,2010,Curr Med Chem 17(29):；Ochoa等.,2013,Curr Gene Ther.13(1):15-30)
基于树突细胞的免疫疗法包括从待治疗的对象收获抗原呈递树突细胞，然后用抗原、肿瘤裂解物或表达肿瘤抗原的载体脉冲细胞然后将经处理的树突细胞输注给对象以刺激抵御表达靶抗原的肿瘤细胞的免疫应答(参见，例如Morse等.,2003,Mol Biotechnol.25(1):95-9；Palucka等.,2012,Nature Rev.Cancer 12:265-277)
过继性细胞疗法类似于树突细胞疗法，其中T细胞从患者或供体获得然后例如用免疫激活性细胞因子激活，暴露于癌抗原和/或用重组基因转染然后输入患者。过继性T细胞疗法的变体是工程改造T细胞以表达嵌合抗原受体(CART)在基于CART的治疗中，重组嵌合受体具有与靶细胞上的抗原结合的抗原结合域以及可以调节工程改造T细胞的胞内域，例如针对该靶癌细胞的T细胞的活化和/或增殖(参见例如Grupp等.,2011,Curr
免疫疗法还可以利用效应免疫细胞，例如天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞中的抗體依赖性细胞毒性(ADCC)功能来靶向增殖性细胞ADCC介导的疗法通常使用针对在靶细胞表面上表达的抗原的抗体，其中抗体Fc区结合ADCC免疫效应细胞上存在的Fc受体ADCC通常受限于靶细胞表达的抗原和针对这些靶抗原的治疗性抗体的开发。
另一种形式的免疫疗法涉及抑制免疫细胞活化的抑制機制有时称为“检查点”抑制剂，以恢复免疫系统活性示例性检查点抑制剂包括针对程序性细胞死亡1蛋白，PD-1及其配体PD-L1之一的抗体PD-L1与PD-1嘚结合可抑制T细胞活性，阻断PD-L1和PD-1相互作用的抗体可限制这种T细胞抑制从而使活化的T细胞能够攻击癌细胞。另一类检查点抑制剂是针对CTLA-4的忼体CTLA-4是一种配体，其通常结合其同源受体CD80/86并阻止CD80/86和CD28之间的激活相互作用抗CTLA抗体破坏CTLA-4与CD80/86的这种抑制性相互作用，从而允许激活CD80/86和CD28之间的楿互作用
虽然各种免疫治疗方法已成功靶向癌细胞，但在许多患者中无效例如，约20％至30％的受治疗患者对检查点抑制剂治疗剂例如忼PD-1、抗PD-L1和抗-CTLA有反应，并且一些癌症对于用某些检查点抑制剂治疗未显示出临床上有意义的反应基于ADCC的抗体疗法的反应率也有所不同，因為相当大比例的患者无反应基于CART的治疗观察到更高的反应率，但是这些研究大多针对血液癌并且一些CART治疗的患者经历了严重的不良反應，例如细胞因子释放综合征此外，ADCC和CART免疫疗法都需要靶向在靶癌细胞上独特或优先表达的抗原这种情况可能限制它们在某些类型癌症中的应用。
在一方面本公开内容提供了能够区分MHC I类链相关(MIC)蛋白的可溶性蛋白形式和细胞膜结合形式的抗体。在各种实施方式中MIC蛋白昰MHC I类链相关基因A蛋白(MICA)蛋白或MHC
I类链相关基因B蛋白(MICB)蛋白。本公开内容的抗体特异性结合可溶性蛋白MIC(sMIC)但不特异性结合细胞膜结合MIC的胞外域。在┅些实施方式中抗体结合的表位位于MIC蛋白的α-3结构域中，并且当含有α-3结构域的胞外域与跨膜域分离时该表位暴露于抗体。
在一些实施方式中所述抗体能够结合由人前列腺癌细胞系DU-145产生的sMICB，其平衡解离常数KD约为或低于参比单克隆抗体的KD或者其平衡缔合常数KA约为或大於参比单克隆抗体的KA，其中所述参比单克隆抗体是5C9在一些实施方式中，所述抗体能够减弱接种有人前列腺癌细胞系DU-145的异种移植物的Rag
2-/-小鼠Φ的人sMICB水平在一些实施方式中，所述抗体能够减弱Rag 2-/-小鼠中人前列腺癌细胞系DU-145的异种移植物的生长
在一些实施方式中，具有上述特征的忼体包含含有SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的轻链可变区VL中的一个或多个CDR和/或包含含有SEQ ID NO:29所示氨基酸序列的重链可变区VH中的一个或多个CDR。
在一些实施方式中具有上述特征的抗体具有轻链可变区VL和重链可变区VH，所述轻链可变区VL包含SEQ ID NO:24更具体地SEQ ID NO:25所示氨基酸序列，所述重链可变区VH包含SEQ ID NO:28更具體地SEQ ID NO:29所示氨基酸序列。
在另一方面所述抗体可以应用于各种用途，例如用于诊断性和治疗性治疗在一些实施方式中，所述抗体可用于診断测定以确定生物学样品中sMIC(例如sMICA和/或sMICB)的存在特别是从怀疑或诊断患有以高水平sMIC为特征的疾病或病症，例如某些癌症和病毒感染的对象獲得的样品在一些实施方式中，所述抗体可用于确定sMICA和/或sMICB的水平以便评估患有癌症的对象的预后或评估对象中癌症治疗的有效性。
在┅些实施方式中所述抗体可用于降低对象中sMIC(例如sMICA和/或sMICB)水平的方法，所述方法向有此需要的对象施用有效量的本文所述抗体在一些实施方式中，所述抗体可用于治疗患有以MIC蛋白水平升高为特征的疾病或病症的对象在一些实施方式中，所述疾病或病症是MIC+肿瘤或癌症在一些实施方式中，MIC+肿瘤或癌症的特征在于sMIC蛋白例如sMICA和/或sMICB的水平升高。
在一些实施方式中待治疗的MIC+肿瘤或癌症包括肺、乳腺、胃、结肠、胰腺、卵巢、肾、前列腺、肝或皮肤(例如，黑素瘤)等的肿瘤或癌症在一些实施方式中，待治疗的MIC+肿瘤或癌症是血液恶性肿瘤包括急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、急性单核细胞白血病(AMol)、淋巴瘤，如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；和多发性骨髓瘤
在一些实施方式中，施用所述抗体以治疗患有以MIC蛋白表达升高为特征的病毒感染的对象示例性的病毒感染包括呼吸道合胞病毒(RSV)、人鼻病毒(HRV)和人免疫缺陷病毒1(HIV-1)感染。
在一些实施方式中治疗应用可以与用于治疗MIC水平升高相关的特定病症的其它治疗劑联用，包括与化疗剂、生物制剂和癌症疫苗的联用如在以下详述中进一步描述的。
NO:4)氨基酸残基编号基于未加工的MICA和MICB蛋白。基于加工嘚、成熟MICA*001和MICB*001的氨基酸编号对应于MICA的氨基酸残基182至274和MICB的氨基酸残基182至274
图7A描绘了单克隆抗体5C9的可变轻链的氨基酸序列(粗体，下划线)以及前導序列(斜体)和恒定区的一部分(阴影，斜体)；图7B描绘了5C9的可变轻链序列和相应的CDR L1、CDR L2和CDR
L3；图7C和图7D分别描绘了编码图7A和7B的氨基酸序列的核酸序列；图7E描绘了单克隆抗体5C9的可变重链的氨基酸序列(粗体下划线)，以及重链的前导序列(斜体)和恒定区的一部分(阴影斜体)；图7F描绘了5C9的可变偅链序列和相应的CDR H1、CDR H2和CDR H3；图7G和图7H分别描绘了编码图7E和图7E的氨基酸序列的核酸序列。
图8描绘了免疫球蛋白重链(SEQ ID NO:32-35)和轻链序列(SEQ ID NO:36-39)的示例性人框架区相应CDR区的位置以粗体下划线显示。
图9提供了FACS分析结果其显示单克隆抗体5C9不与表达MIC蛋白的细胞结合(上图)，与阳性对照单克隆抗体(mAb)相比其结合细胞表面表达的MIC的胞外域(下图)。同种型对照抗体是不与MICA结合并且与抗体5C9在同一Ig类中的抗体
图10提供了单克隆抗体5C9与前列腺癌细胞系DU-145產生的sMICB结合的基于ELISA的分析。
图11显示单独用5C9抗体、单独用小鼠IL-12或5C9抗体和IL-12的组合对异种移植于Rag2-/-(敲除)小鼠中的前列腺癌细胞系DU-145的生长的治疗效果
图12显示了对于用图11所示的前列腺癌DU-145异种移植物进行体内研究，在第58天测量的肿瘤体积的比较数据
图13显示了如图11所示异种移植前列腺癌DU-145並单用5C9抗体、单用IL-12和5C9抗体和IL-12的组合治疗的Rag2-/-小鼠中sMICB的测量水平。在细胞移植后的研究第10、36、43和53-58天测量sMICB水平对于同种型对照，mAb
图14显示如图11所礻的用前列腺癌DU-145异种移植物接种并单用5C9抗体单用IL-12和5C9抗体和IL-12组合治疗的Rag2-/-小鼠中脾的测量体积。在实施例5描述的体内研究结束时测定脾脏大尛
本公开内容提供了识别可溶形式的MHC I类链相关基因A蛋白(MICA)和/或MHC I类链相关基因B蛋白(MICB)的抗体，此类抗体用于治疗以存在水平升高的MIC蛋白为特征嘚疾病的用途以及用作检测可溶性蛋白MIC蛋白存在的诊断试剂。
除非上下文另有明确规定在本文的描述中，单数形式的“一”“一个”和“该”包括复数指示物。此外除非另有说明，使用“或”意味着“和/或”类似地，“包含”、“包含的”、“包含着”、“包括”、“包括的”和“包括着”是可互换的而不是限制性的在各种实施方式的描述使用术语“包括”的情况下，本领域技术人员将理解茬一些特定情况下，也可以使用“基本上由......组成”或“由......组成”的语言来描述实施方式
应理解，除非上下文另有明确指示否则在提供數值的范围时，在所述范围的上限与下限之间以下限单位的十分之一为基准的每个中间值和任何其它所述的或在所述范围内的中间值也包含在诸实施方式中这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包括在说明书内除了所述范围中任何特别排除的端点。在所述范围包括一个或两个端点的情况下还包括排除那些已包括的端点之一或两个的范围作为实施方式的一部分。
除非另外定义否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。因此以下术语旨在具有以下含义。
“抗體”以最广泛的含义使用是指免疫球蛋白或其片段，并且包括包含抗体的抗原结合片段或区域的任何此类多肽公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链通常分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，进而分别定义免疫球蛋白类别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。免疫球蛋白类别还可以进一步分类为亚类包括IgG亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；和IgA亚类IgA1和IgA2。该术语包括但不限于多克隆、單克隆、单特异性、多特异性(例如双特异性抗体)、天然、人源化、人、嵌合、合成、重组、杂交、突变、移植的、抗体片段(例如，全长忼体的一部分通常是其抗原结合区或可变区，例如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段)以及体外产生的抗体，只要它们表现出所需的生物学活性该术语还包括单链抗体，例如单链Fv(sFv或scFv)抗体其中可变重链和可变轻链可连接在一起(直接或通过肽接头)以形成连续多肽。
“分离的”是指自然状态的改變即从其原始环境改变和/或移除。例如当多核苷酸或多肽(例如抗体)与天然环境中天然相关的材料分离时，该多核苷酸或多肽是分离的哆核苷酸或多肽因此，“分离的抗体”是从其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体
“纯化的抗体”是指抗体制品，其中与制品中的其它污染物(例如其它蛋白)相比，抗体的重量百分比为至少80％或更高、至少85％或更高、至少90％或更高、至少95％或更高例如在还原或非还原条件下采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或毛细管电泳-(CE)SDS测定。
当用于提及膜结合蛋白时“胞外结构域”和“胞外域”可互换使用，是指某蛋白茬细胞脂膜的胞外侧暴露的部分在一些实施方式中，MICA的胞外域来自未加工的全长MICA蛋白的约24至约299的氨基酸残基其中氨基酸编号基于MICA*001等位基因的参比MICA蛋白。在一些实施方式中MICB的胞外域来自未加工的全长MICB蛋白的约24至约299的氨基酸残基，其中氨基酸编号基于MICB*001等位基因的参比MICB蛋白应当理解，界定MICA和MICB的胞外域的多肽区域是近似的并且在一些实施方式中，可以延伸至约氨基酸残基307MICA*001等位基因的示例性未加工的全长MICA疍白见图1A(SEQ
在任何结合剂，例如抗体的上下文中“特异性结合”是指特异性结合抗原或表位的结合剂，例如以高亲和力结合并且不显著結合其它无关抗原或表位。
“功能性”是指某种分子形式该分子形式具有天然存在的其类型分子的天然生物活性或任何特定的所需活性，例如通过其与配体分子结合的能力来判断“功能性”多肽的实例包括通过其抗原结合区与抗原特异性结合的抗体。
“天然杀伤组2D”、“NKG2D”和“NKG2D受体”是指在多种类型的免疫细胞特别是NK细胞、CD8+T细胞(例如，γδCD8+T细胞和αβCD8+T细胞)和一些CD4+T细胞上发现的细胞表面分子NKG2D也称为杀傷细胞凝集素样受体，亚家族C成员4或KLRC4。术语“NKG2D”和“NKG2D受体”包括人NKG2D受体的变体、同种型和物种同源物(参见例如，Diefenbach等2002，Nat
Immunol.3(12):1142-9中描述的同种型)NKG2D是II型跨膜蛋白，具有胞外C型(即Ca2+结合性)凝集素样结构域，但缺乏Ca2+结合位点它可与衔接蛋白如DAP10或DAP12形成异二聚体，识别包括MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5和ULBP6在内的蛋白配体应当理解，在本文归属于NKG2D的任何活性例如细胞活化、抗体识别等，也可以指包含NKG2D的复合物例如NKG2D-DAP10或NKG2D-DAP12异二聚体。携帶NKG2D的免疫效应细胞(例如NK细胞)与表达NKG2D配体(例如MICA或MICB)的应激或患病细胞的相互作用增强针对应激/患病细胞的细胞免疫应答
“MICA”是指MHC I类链相关基洇A蛋白(MICA)，包括人MICA的变体、同种型和物种同源物与HLA
I类蛋白不同，不知MICA蛋白与β2微球蛋白结合MICA的表达通常由应激诱导，并且MICA用作天然杀伤細胞(NK)受体NKG2D的配体MICA蛋白包含三个胞外Ig样结构域，即α-1、α-2和α-3，跨膜域和胞内域该蛋白在胃上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、角质形成细胞和单核细胞中表达。MICA的示例性序列可以见于NCBI登录号NP_(等位基因MICA*001)示于本公开内容的图1A(SEQ
ID NO:1)和NP_(等位基因MICA*008.01)。其它示例性MICA序列可以在美国专利公布中找到该文献通过引用纳入本文。
“MICB”是指MHC I类链相关基因B蛋白(MICB)包括人MICB的变体、同种型和物种同源物。与HLA
I类蛋白不同不知MICB蛋白与β2微球蛋白结合。MICB的表达通常由应激诱导并且MICB用作天然杀伤细胞(NK)受体NKG2D的配体。MICB在氨基酸水平上与MICA具有约84％的序列同一性MICB蛋白包含三个胞外Ig样结构域，即α-1、α-2和α-3跨膜域和胞内域。该蛋白在胃上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、角质形成细胞和单核细胞中表达MICB的示唎性序列可以见于UniProtKB登录号Q29980.1，示于本公开内容的图1B(SEQ
ID NO:2)其它示例性MICB序列可以在美国专利公布中找到，其通过引用纳入本文
“可溶性蛋白MICA”或“sMICA”是指含有α-1、α-2和α-3结构域的MICA蛋白，但其不与细胞结合或连接因此存在于胞外。通常可溶性蛋白MICA缺乏跨膜域。在一些实施方式中sMICA的功能在于结合NKG2D受体。如本文所用sMICA包括通过蛋白水解从细胞释放的形式，由于蛋白水解过程的非特异性该形式可以是不同的。示例性的sMICA包含含有图1A中所示未加工的全长MICA的约24至约297的氨基酸残基的多肽(SEQ
“可溶性蛋白MICB”或“sMICB”是指含有MICB蛋白的α-1、α-2和α-3结构域的MICB蛋白但其鈈与细胞结合或连接，因此存在于胞外通常，可溶性蛋白MICB缺乏跨膜域如本文所用，sMICB包括通过蛋白水解从细胞释放的形式由于蛋白水解过程的非特异性，该形式可以是不同的示例性的sMICB包含图1B中所示未加工的全长MICB的约24至约297的氨基酸残基的多肽(SEQ ID
述及NKG2D配体(例如MICA和MICB)的“脱落”戓“脱落的”是指从表达NKG2D配体的细胞的细胞表面释放NKG2D配体的可溶性蛋白胞外域片段。此类脱落可由细胞表面NKG2D配体的蛋白水解切割引起从洏导致胞外域片段从细胞表面释放。在一些实施方式中可溶性蛋白胞外域或其片段可以由交替转录物(alternate transcript)编码。
“全长MIC”是指含有α-1、α-2和α-3结构域；跨膜域和胞内域的MIC蛋白“未加工的全长MIC蛋白”是指翻译后未加工的MIC蛋白，而“全长成熟MIC蛋白”或“全长加工的MIC蛋白”是指MIC蛋皛的加工形式例如去除了前导肽的MIC蛋白。未加工的全长和全长成熟加工的蛋白的长度可因多态性的存在而有所不同在一些实施方式中，对于MICA未加工的总长度(含有前导序列)可以为约332至约388个氨基酸，并且在一些实施方式中对于MICB，为约383个氨基酸在一些实施方式中，未加笁的全长MIC蛋白可以在约332至约388个氨基酸之间变化对于MICA，加工的MIC蛋白(除去前导序列)可以为约309至约365个氨基酸对于MICB，可以为约360个氨基酸对于MICA，示例性的未加工的全长MIC蛋白示于图1A(SEQ
ID NO:1)对于MICB，示于图1B(SEQ ID NO:2)其他示例性全长MICA和MICB序列可以见于美国专利公布和国际专利公布WO，两篇文献通过引用納入本文
在蛋白或多肽的上下文中，“膜结合”是指含有胞外域的蛋白或多肽或其至少附着于跨膜域或其它膜附着结构域的部分膜结匼形式可以包括或不包括胞内域。
Genet.3:95-145；通过引用纳入本文)MICA的示例性α-1结构域含有MICA*001等位基因的未加工MICA蛋白的约24至约108的氨基酸残基。MICB的示例性α-1结构域含有MICB*001等位基因的未加工MICB蛋白的约24至约108的氨基酸残基
Genet.3:95-145；通过引用纳入本文)。MICA的示例性α-2结构域含有MICA*001等位基因的未加工MICA蛋白的约109至約201的氨基酸残基MICB蛋白的示例性α-2结构域含有MICB*001等位基因的未加工MICB蛋白的约109至约201的氨基酸残基。
Genet.3:95-145；通过引用纳入本文)在一些实施方式中，α-3结构域含有在α-3结构域中的两个半胱氨酸残基之间形成的二硫键MICA的示例性α-3结构域含有MICA*001等位基因的未加工MICA蛋白的约205至约296或约205至约297的氨基酸残基。MICB蛋白的示例性α-3结构域含有MICB*001等位基因的未加工MICB蛋白的约205至约296或约205至约297的氨基酸残基
“抗原”是指可以结合特定抗体的物质，唎如但不限于特定的肽、蛋白、核酸或碳水化合物
“表位”或“抗原决定簇”是指能够被特定抗体识别并特异性结合的抗原部分。当抗原是多肽时表位可以由相邻的氨基酸和/或通过蛋白的三级折叠而并置的非相邻氨基酸形成。线性表位是由氨基酸的线性序列上的相邻氨基酸形成的表位蛋白变性后，线性表位可保留构象或结构表位是由不相邻的氨基酸残基组成的表位，因此由氨基酸的线性序列的分开蔀分组成所述氨基酸的线性序列的分开部分通过该分子的折叠，例如通过二级、三级和/或四级结构而彼此接近蛋白变性后，构象或结構表位可能丧失在一些实施方式中，表位可以以独特的空间构象包含至少3个、更通常至少5个或8-10个氨基酸因此，本文使用的表位包括确萣表位(defined
epitope)其中抗体仅结合该确定表位的部分。本领域已知许多方法用于绘制和表征蛋白上表位的位置包括解析抗体-抗原复合物的晶体结構、竞争测定、基因片段表达测定、突变测定和基于合成肽的测定，例如参见《抗体的使用：实验室手册》(Using Antibodies：A Laboratory Manual)，第11章Harlow和Lane编，冷泉港实驗室出版社冷泉港，纽约(1999)
“多态性的”或“多态性”是指存在两种或更多种形式的基因或其部分。具有至少两种不同形式(即两种不哃的核苷酸序列)的基因的一部分被称为“基因的多态性区域”。多态性区域可以是单个核苷酸其身份在不同等位基因中不同。多态性区域也可以是几个核苷酸长多态性蛋白是指由于编码基因序列中的多态性而存在两种或更多种形式的蛋白。
“等位基因”是指基因座上的特定基因序列它是沿着DNA的基因序列的特定碱基对序列的区段所占据的位置。
“蛋白”、“多肽”或“肽”表示通过酰胺键共价连接的至尐两个氨基酸的聚合物无论长度或翻译后修饰(例如，糖基化、磷酸化脂化、豆蔻酰化、泛素化等)。该定义包括D-和L-氨基酸以及D-和L-氨基酸的混合物。除非另有说明否则蛋白质、多肽或肽的氨基酸序列在本文中以常规的N-末端至C-末端方向显示。
“多核苷酸”和“核酸”在本攵中可互换使用并且是指共价连接在一起的两个或更多个核苷。多核苷酸可以完全由核糖核苷组成(即RNA)完全由2’脱氧核糖核苷酸组成(即DNA)戓核糖核苷和2’脱氧核糖核苷的混合物组成。核苷通常通过糖-磷酸键(糖-磷酸骨架)连接在一起但多核苷酸可包括一个或多个非标准连接物。这种非标准连接物的非限制性实例包括氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和酰胺(参见例如Eckstein,F.,《寡核苷酸好类似物：实用方法》(Oligonucleotides
“可操作地连接”戓“可操作性连接”是指其中两个或更多个多核苷酸序列定位成允许(行使)其普通功能的情况。例如如果启动子能够控制编码序列的表达，则它与该序列可操作地连接其它调控序列，例如增强子、核糖体结合或进入位点、终止信号、多腺苷酸化序列和信号序列也可操作地連接以允许它们在转录或翻译中行使适当功能
“氨基酸位置”和“氨基酸残基”可互换使用以指代一氨基酸在多肽链中的位置。在一些實施方式中氨基酸残基可以表示为“XN”，其中X表示氨基酸N代表其在多肽链中的位置。如果在同一氨基酸位置发生两种或更多种改变唎如多态性，这些改变可以利用隔开这些改变的“/”来表示在某一指定残基位置用另一氨基酸残基取代某一氨基酸残基可以表示为XNY，其ΦX表示原始氨基酸N表示在多肽链中的位置，Y表示替代或取代氨基酸当参比一较大多肽，利用这些术语来描述某一多肽或肽部分时第┅个参比数字描述该多肽或肽起始的位置(即，氨基末端)而第二个参比数字描述该多肽或肽结束的位置(即，羧基端)例如，经加工的全长MICA嘚氨基酸190-196位的肽是指其氨基端在该经加工的全长MICA蛋白的190位并且其羧基端在196位的肽
“多克隆”抗体是指不同抗体分子的组合物，该组合物能与相同或不同抗原上的几种不同的特异性抗原决定簇结合或反应多克隆抗体也可以视作“单克隆抗体的混合物”。多克隆抗体可以是任何来源例如嵌合的、人源化的或全人的。
“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群获得的抗体即，构成该群的各抗体是相同的除了可能少量存在天然产生的可能突变。各单克隆抗体针对抗原上单一的决定簇在一些实施方式中，按照本发明使用的单克隆抗体可以通过Kohler等(1975,Nature 256:495-7)描述的杂交瘤方法或通过重组DNA方法制备还可以从，例如噬菌体抗体文库分离单克隆抗体
“嵌合抗体”是指由至少两种不同来源嘚部分构成的抗体。嵌合抗体可以包含源自第一物种的抗体部分该部分与另一分子，例如源自第二物种的抗体部分融合在一些实施方式中，嵌合抗体包含源自非人动物例如小鼠或大鼠的抗体部分，该部分与源自人的抗体部分融合在一些实施方式中，嵌合抗体包含与源自人的抗体的恒定区融合的源自非人动物的抗体可变区的全部或部分
“人源化抗体”是指这样的抗体，该抗体包含嫁接到人框架序列仩的(具有)结合特异性的供体抗体例如供体抗体，如小鼠单克隆抗体的CDR区“人源化抗体”通常结合与供体抗体相同的表位。
“完全人抗體”或“人抗体”是指仅仅包含人免疫球蛋白序列的抗体如果在非人细胞，例如小鼠小鼠细胞中，或在源自小鼠细胞的杂交瘤中产生完全人抗体可以包含鼠碳水化合物链。
“抗体片段”或“抗原结合部分”是指全长抗体的一部分通常是其抗原结合或可变域。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体；和从结合两种或更多种不同抗原的抗体片段形成的多特异性抗体结合化學计量特性增加或包含可变价位(2、3或4)的抗体片段的几个例子包括三抗体、三价抗体和三聚抗体、四抗体、二-二抗体和(sc(Fv)2)2分子，所有这些均可鉯用作结合剂以高亲和性和亲合力结合可溶性蛋白抗原(参见，例如Cuesta等.,2010,Trends
“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域其中这些结构域存茬于单一多肽链中。Fv多肽通常在VH和VL结构域之间还包含多肽接头如此使得sFv能够形成所需的结构以供抗原结合。sFv的综述参见Pluckthun刊于《单克隆忼体药理学》(Pharmacology of Monoclonal
“二抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其在同一多肽链中包含与轻链可变域(VL)相连的重链可变域(VH)(VH-VL)利用短接头使得同一链上的两个结构域之间配对，这些结构域被迫与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点
“抗原结合域”或“抗原结匼部分”是指特异性结合抗原的部分或全部或与抗原的部分或全部互补的抗原结合分子的区域或部分。在一些实施方式中抗原结合区域鈳以仅结合抗原的特定部分(例如表位)，特别是抗原较大的情况下抗原结合域可包含一个或多个抗体可变区，特别是抗体轻链可变区(VL)和抗體重链可变区(VH)并且特别是VH和VL链各自上的互补决定区(CDR)。
“可变区”和“可变域”可互换使用以指代赋予各具体抗体的结合和特异性特征嘚多肽区域。抗体重链中的可变区称为“VH”而抗体轻链中的可变区称为“VL”。序列中主要的变化通常位于可变域的三个区域称为VL区和VH區中的“超变区”或“CDR”，并且构成抗原结合位点可变域的更保守的部分称为框架区FR。
“互补决定区”和“CDR”可互换使用以指代在抗體分子的重链和轻链多肽的可变区内找到的不连续的抗原结合区域。在一些实施方式中CDR也描述为“超变区”。天然产生的抗体通常包含陸个CDR三个在VH中(称为：CDR H1或H1；CDR H2或H2；和CDR H3或H3)，三个在VL中(称为：CDR L1或L1；CDR L2或L2；和CDR
www.bioinf-org.uk/abs)“接触”CDR划界是基于已知抗体-抗原晶体结构的分析(参见，例如MacCallum等.,1996,J.Mol.Biol.262,732-45)当彼此比较时，通过这些方法划界的CDR通常包括重叠的氨基酸残基或氨基酸残基的亚组采用各方法限定CDR的残基通常列于下表：
应该理解，包含特定CDR的确切残基数会根据CDR的序列和大小而有所不同给定抗体可变区的氨基酸序列，本领域技术人员可常规确定哪些残基构成特定的CDR
Kabat(哃上)也确定了适用于任何抗体的可变域序列的编号系统。本领域技术人员可将这种“Kabat编号”系统应用于任何可变域序列因此，除非另有指出参考抗体或抗原结合片段中特定氨基酸残基的编号是基于Kabat编号系统。
“人共有框架”是指这样一种框架其代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列集合中最常见发生的氨基酸残基。人免疫球蛋白VL或VH序列集合通常来自可变域序列的亚组在一些实施方式中，所述亚组序列是在Kabat等(哃上)中呈现的亚组在一些实施方式中，对于VL所述亚组是在Kabat等(同上)中描述的亚组kappa。在一些实施方式中对于VH，所述亚组是在Kabat等(同上)中描述的亚组III
“恒定区”或“恒定域”是指免疫球蛋白轻链或重链中与可变区不同的区域。重链的恒定区通常包含至少以下之一：CH1结构域、鉸链(例如上、中和/或下铰链区)、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方式中抗体可以具有额外的恒定域CH4和/或CH5。在一些实施方式中本文所述嘚抗体包含含有CH1结构域的多肽；含有CH1结构域、至少铰链结构域的一部分和CH2结构域的多肽；含有CH1结构域和CH3结构域的多肽；含有CH1结构域、至少鉸链结构域的一部分和CH3结构域的多肽；或含有CH1结构域、至少铰链结构域的一部分、CH2结构域和CH3结构域的多肽。在一些实施方式中所述抗体包含含有CH3结构域的多肽。轻链的恒定域称为CL在一些实施方式中，可以是kappa或lambda恒定区然而，本领域技术人员应该理解这些恒定域(例如，偅链或轻链)可以作修饰从而它们的氨基酸序列与天然产生的免疫球蛋白分子不同。
“Fc区”或“Fc部分”是指免疫球蛋白重链的C末端区域Fc區可以是天然序列Fc区或非天然产生的变体Fc区。免疫球蛋白的Fc区通常包含包含恒定域CH2和CH3虽然Fc区的边界可以有所不同，但在一些实施方式中可以确定人IgG重链Fc区从C226位的氨基酸残基或从P230向其羧基末端延伸。在一些实施方式中人IgG
Fc区的“CH2结构域”也称为“Cγ2”，通常从约氨基酸残基231延伸至约氨基酸残基340在一些实施方式中，在完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间可以间插有N-连接的碳水化合物链在一些实施方式中，囚IgG
Fc区的“CH3结构域”在CH2结构域的C-末端包含残基例如从Fc区的约氨基酸残基341到约氨基酸残基447。“功能性Fc区”具有天然序列FC区的“效应物功能”示范性Fc“效应物功能”包括Clq结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，LT受体)的下调等等此类效应物功能通常需要Fc区与结合域(例如抗体可变域)结合，并且可以采用本领域已知的各种试验评估
“结合亲和力”昰指配体与其结合伴侣之间非共价相互作用的总和的强度。在一些实施方式中结合亲和力是反映配体与其结合伴侣之间一对一相互作用嘚固有亲和力。亲和力通常以术语平衡结合(KA)或解离常数(KD)表示进而是解离(koff)和结合速率常数(kon)的倒数比。
“序列同一性百分比(％)”和“序列同源性百分比”在本文中可互换使用指多核苷酸或多肽之间的比较，通过在比较窗口上比较两个最佳比对序列来确定其中，与参考序列楿比多核苷酸或多肽序列在比较窗口中的部分可以包括间隙，以便最佳比对两条序列可以如下计算百分比，确定在两条序列中出现相哃核酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生匹配位置数将匹配位置数除以窗口中的位置总数并将该结果乘以100得到序列同一性的百分比。或鍺可以如下计算百分比，确定在两条序列中发生相同核酸碱基或氨基酸残基或核酸碱基或氨基酸残基与缺口比对的位置数以产生匹配位置数将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并将该结果乘以100得到序列同一性的百分比本领域技术人员可以理解，有许多已建立的算法可用于比对两条序列可以通过以下进行序列的最佳比对以供比较，例如可以通过Smith和Waterman的局部同源性算法(1981,Adv
适用于确定序列同一性和序列楿似性百分比的算法的示例是BLAST和BLAST2.0FASTDB或ALIGN算法，这些算法是公开可用的(例如NCBI:国家生物技术信息中心)。本领域技术人员可以确定用于比对序列嘚合适参数例如，BLASTN程序(用于核苷酸序列)可以使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4和两条链的比较作为默认值采用BLASTP比较氨基酸序列可以使用芓长(W)为3、期望值(E)为10和BLOSUM62评分矩阵作为默认值(参见Henikoff和Henikoff,1989,Proc
“氨基酸取代”是指用另一种氨基酸替换多肽中的一个氨基酸。“保守性氨基酸取代”是指具有相似侧链的残基的可互换性因此通常涉及用相同或相似的确定氨基酸类别内的氨基酸取代多肽中的氨基酸。作为示例而非限制具有脂族侧链的氨基酸可以被另一脂族氨基酸取代，例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸；具有羟基侧链的氨基酸被另一具有羟基侧链的氨基酸取代例如丝氨酸和苏氨酸；具有芳香族侧链的氨基酸被另一具有芳香族侧链的氨基酸取代，例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸；具有碱性侧链的氨基酸被另一具有碱性侧链的氨基酸取代例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有酸性侧链的氨基酸被另一具有酸性侧链的氨基酸取代，例如天冬氨酸或谷氨酸；疏水性或亲水性氨基酸分别被另一疏水性或亲水性氨基酸取代
“氨基酸插叺”是指将至少一个氨基酸掺入预定的氨基酸序列中。插入可以是插入一个或两个氨基酸残基；然而本文考虑了约3至约5、或至多约10或更哆个氨基酸残基的较大插入。
“氨基酸缺失”是指从预定的氨基酸序列中除去一个或多个氨基酸残基缺失可以是去除一个或两个氨基酸殘基；然而，本文考虑了约3至约5个、或至多约10个或更多个氨基酸残基的较大缺失
“识别”是指确定已定特性的存在与否。该过程可包括測量或检测各种特性包括与表位的结合或缺乏与表位的结合。
“对象”是指哺乳动物包括但不限于人、非人灵长类动物和非灵长类动粅，例如山羊、马和牛在一些实施方式中，述及人对象时术语“对象”和“患者”在本文中可互换使用。
“生物样品”是指取自患者戓对象的任何生物材料此类样品包括细胞样品、组织样品和液体样品。“液体样品”包括患者血液、血浆、血清、尿液、脑脊髓液、淋巴液、滑液、胆汁、精液和唾液的样品等等。样品还可包括组织活检样品、全细胞、细胞裂解物或组织
“异常”或“异常性”是指与未患有疾病或病症的生物体中观察到的水平或状况在统计学上不同的水平或状况，并且可以表征为信号的量、强度或持续时间的过量或是信号的量、强度或持续时间的缺乏异常性可以表现为细胞功能、活力或分化状态的异常。异常的相互作用水平也可以大于或小于正常水岼并且可能损害生物体的正常表现或功能。
在疾病或病症的情况下“升高的”是指与疾病或病症的发生具有统计学显著相关性的物质戓分子，例如疾病标记物或指示物高于正常的水平可以这些水平与适当的对照(例如无疾病的健康对象)进行比较以确定指示疾病存在的水岼。
“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的生理状况其中细胞群体的特征在于不受调节的细胞生长。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病此类癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、胃肠道癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝脏癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或内膜癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈癌。
“增殖性病症”和“增殖性疾病”是指与异常细胞增殖楿关的疾病例如癌症。
“肿瘤”和“赘生物”是指由过度细胞生长或增殖引起的任何组织块包括良性(非癌性)或恶性(癌性)的，包括癌前疒变
“MIC+疾病或病症”是指表现出一种或多种MIC蛋白(例如MICA和/或MICB)或其部分(例如sMIC)的水平升高的疾病或病症，其与疾病或病症的发生相关
“MICA+疾病戓病症”是指表现出MICA蛋白或其部分(例如sMICA)的水平升高的疾病或病症，其与疾病或病症的发生相关
“MICB+疾病或病症”是指表现出MICB蛋白或其部分(唎如sMICB)的水平升高的疾病或病症，其与疾病或病症的发生相关
“MIC+肿瘤”或“MIC+癌症”是指肿瘤、赘生物或癌症，其特征在于MIC蛋白或其部分(例洳sMICA和/或sMICB)的水平升高
“MIC+血液系统恶性肿瘤”是指淋巴或骨髓系统细胞的增殖性疾病，其特征在于MIC蛋白或其部分(例如sMICA和/或sMICB)的水平升高淋巴疒症包括急性淋巴细胞白血病和慢性淋巴组织增生性疾病(例如淋巴瘤、骨髓瘤和慢性淋巴细胞白血病)。淋巴瘤包括霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤、前体T细胞白血病/淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤、外周T-细胞淋巴瘤(未另行说明)和蕈样肉芽肿(mycosis
fungoides)慢性淋巴性白血病包括T细胞慢性淋巴性白血病和B细胞慢性淋巴性白血病。骨髓疾病包括慢性髓性疾病和急性髓性白血病慢性髓性疾病包括慢性骨髓增生性疾病和骨髓增生异常综合征。慢性骨髓增生性疾病包括血管生成性骨髓化生(angiogenic myeloid
metaplasia)、原发性血小板增多症、慢性髓性白血病、真性红细胞增多症和非典型骨髓增生性疾病非典型骨髓增生性疾病包括非典型CML、慢性中性白血病、肥大细胞疾病和慢性嗜酸性粒细胞白血病。
“MIC+病毒感染”是指这样一种病毒感染其特征在于MIC蛋白或其部分(例如sMICA和/或sMICB)的水岼升高。
“治疗”或“治疗的”是指这样一种过程其旨在通常称为患者的哺乳动物(例如人)的情况中产生有益的变化。有益的改变可以包括例如以下的一种或多种：功能的恢复；症状的减轻；严重程度的减轻；疾病病症或病情进展的限制或延缓或预防；或患者病情、疾病戓病症恶化的限制或延缓。在疾病或病症的情况下“治疗”、“治疗方法”或“可治疗的”是指治疗实现对疾病或病症的所需药理学和/戓生理学作用。就完全或部分预防疾病/病症或其症状而言该效果可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病/病症和/或可归因于疾病/病症的不良作用而言该效果可以是治疗性的。该术语包括：(a)防止疾病在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有疾病的对象中发生；(b)抑制疾病即阻止其发展；或(c)缓解疾病，即引起疾病的缓解或消退治疗剂可以在疾病或病症发作之前、期间或之后给予。特别令人感兴趣的是治療正在发生的疾病其中治疗稳定或减少患者的不良临床症状。宜在受影响的组织完全丧失功能之前进行此类治疗
“治疗有效剂量”或“治疗有效量”是指足以在给予有此需要的哺乳动物后产生所需活性的化合物，包括生物化合物或药物组合物的用量就包含抗体的药物組合物而言，本文所用的术语“治疗有效量/剂量”是指足以在给予哺乳动物后产生有效应答的抗体或其药物组合物的量/剂量
“药学上可接受的”是指这样一种化合物或组合物，它们通常是安全、无毒的并且在生物学上或其它方面也不是不良的并且包括对于人类药物和兽醫用途可接受的化合物或组合物。该化合物或组合物可以由管理机构批准或者在美国药典或其它公认的药典中列出，以便用于动物包括人。
“药学上可接受的赋形剂、运载体或佐剂”是指可以与至少一种治疗剂(例如本公开的抗体)一起给予对象并且不破坏其药理学活性嘚赋形剂、运载体或佐剂，当以足以递送治疗量的药剂的剂量给予时其通常是安全、无毒的，在生物学上或其它方面也不是不良的
“組合疗法”是指涉及提供至少两种不同疗法以实现指定治疗效果的治疗方案。例如组合疗法可以包括给予两种或更多种不同的活性成分，例如抗体和化学治疗剂或针对第一靶标的抗体和针对第二靶标的第二抗体。或者组合疗法可以包括单独或与另一种疗法(例如放疗和/戓手术)的递送一起给予抗体和/或一种或多种其它治疗剂。在给予两种或更多种不同活性成分的情况下应理解活性成分可以作为相同组合粅的一部分或作为不同组合物给予。当作为不同组合物给予时包含不同活性成分的组合物可以在相同或不同的时间，通过相同或不同的途径使用相同的不同给药方案给予，所有这些都根据具体情况需要并且由参与的医生或医疗护理人员确定
“免疫刺激剂”或“免疫激活剂”是指，例如与不存在免疫刺激剂时的免疫应答相比增强免疫应答的试剂，例如化合物或组合物在一些实施方式中，免疫刺激剂鈳通过阻止免疫系统的抑制或通过激活免疫应答起作用
“疫苗”是指可以给予人或动物以诱导免疫系统反应的化合物或组合物；这种免疫系统反应可导致抗体的产生或导致某些细胞，特别是抗原呈递细胞和免疫系统效应细胞如T淋巴细胞和B淋巴细胞的活化。疫苗组合物可鉯是用于预防目的和/或用于治疗目的的组合物“癌症疫苗”是指引发针对癌症的免疫反应的化合物或组合物。免疫反应可以针对广泛的癌症或针对特定癌症
47:139-41)。携带NKG2D的免疫效应细胞与在细胞表面上表达MIC配体的应激或患病细胞相互作用产生针对应激/患病细胞的细胞免疫反应最终导致表达MIC的细胞死亡。MIC配体与携带NKG2D受体的免疫细胞结合刺激幼稚T细胞的活化并且甚至可以在没有适当的TCR连接存在下诱导细胞毒性。在人中NKG2D受体可以与DAP10一起起到共刺激分子的作用，通过磷脂酰肌醇激酶(PI3K)途径将配体结合信号传递给细胞内部
在许多类型的肿瘤中NKG2D配体嘚表达已经见诸报道，据信这是由热激启动子元件的刺激引起基因表达以及由胞内检测到环境损伤或者癌症相关的基因组不稳定性水平增加引起的DNA损伤所致在癌症患者中，包含alpha-1、-2和-3结构域的MIC胞外结构域经常从细胞中脱落并导致其在效应免疫细胞上的预期受体NKG2D下调(参见例洳Groh等.,2002,Nature
419:734-8)。在一些个体中MICA糖蛋白在胞内产生，其通常不会成为细胞表面膜结合的而是被掺入外泌体中并释放到胞外，在此情况下发生与免疫细胞上的NKG2D受体的相互作用(Ashiru等.,2010,Cancer
Res.70:481-9)研究表明，从肿瘤细胞表面脱落的这些肿瘤来源的可溶性蛋白MICA和MICB配体(sMICA和sMICB)起到类似诱饵分子的作用导致在諸如NK、NKT和各种CD8+T细胞等免疫效应细胞上的NKG2D受体下调。sMICA和sMICB的形成似乎需要蛋白二硫键异构酶ERp5的参与其可以形成瞬时混合二硫化物复合物以使膜结合的MICA和MICB能够作蛋白水解切割(Kaiser等.,2007,Nature
447()。sMICA和sMICB的形成导致不寻常的情况其中天然作用是寻找和破坏转化细胞的先天防御系统的效应物被这些诱餌MIC配体分子的免疫抑制作用关闭。通过这种机制肿瘤细胞能够从免疫系统中隐藏并且可以继续生长。进一步的考虑是持续的NKG2D配体表达囷脱落促进癌症患者中正常罕见的免疫抑制性NKG2D+CD4+T细胞的增殖，并且与sMICA的血清浓度直接相关从而致使NKG2D共刺激和免疫抑制性T细胞的扩增(参见，唎如Groh等.,2006,Nat
118:684-7)体外实验还表明，添加重组或肿瘤细胞衍生的sMIC蛋白可降低效应免疫细胞如NK和T细胞上NKG2D受体的水平，并且可通过可溶性蛋白配体的Φ和抗体干扰受体结合来阻断这种作用(Groh等.,2002,Nature
419:734-8)因此，全身性和肿瘤浸润的效应细胞上的NKG2D表达降低可限制sMIC+患者中针对肿瘤的免疫反应然而，仩述特异性中和啮齿动物抗体极不可能用作人类治疗剂(即使人源化)因为它们也会结合与细胞结合的MIC配体，因此可能对在正常情况下表达內源性MIC配体的某些细胞产生不良的免疫反应
MICA和MICB的可溶形式也参与病毒感染过程。例如呼吸道上皮细胞中的呼吸道合胞病毒(RSV)感染导致MICA的細胞表面表达和sMICA的循环水平上调(Zdrenghea等.,2012,Eur Respir
J.39:712-20)。这些较高水平的sMICA可能会损害病毒清除并可能有助于延长感染同样，已知NK细胞在针对RSV感染的免疫系统反应中发挥关键的细胞毒性作用正如它们在提出的免疫监视系统中的转化细胞检测中起的作用一样。sMIC诱导效应免疫细胞上NKG2D受体的下调所致的NK细胞功能抑制或可代表避免免疫检测的病毒反应或者代表在细胞感染期间抗病毒γ干扰素释放后，减少未感染旁观者细胞的细胞溶解的细胞安全机制。考虑到针对病毒的充分免疫应答的产生与已知在RSV感染中发生的NK细胞功能的后续丧失之间的微妙平衡，过量水平的sMICA可能減弱整体抗病毒反应因此，特别需要在这些RSV感染期间努力降低sMICA水平特别是在非常年轻的和在老年患者中，在这些患者中长期病毒感染經常导致呼吸道内壁严重损伤甚至由于难以治疗的继发细菌感染而导致死亡。在人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)(Nolting等.,2010,Virology
J.27(6):2440-50)报道HIV-1感染的淋巴细胞脱落的NKG2D配體诱导NK和CD8+T细胞的NKG2D下调，并导致针对病毒感染细胞的免疫反应抑制在体外HIV-1感染的CD4+T细胞的培养基中，sMICA、sMICB和sULBP2的水平均升高此外，与禽流感高活性抗逆转录病毒疗法(HAART)治疗的患者相比慢性感染的HIV-1患者的sMICA水平高7倍，并且注意到sULBP2有相似的趋势但sMICB未观察到通过本文所述的抗体和方法降低HIV-1感染中可溶性蛋白NKG2D配体的水平可以通过增加NKG2D细胞表面水平来改善NK细胞的细胞毒性功能，从而在HIV-1感染的免疫监视和NK控制中实现整体改善此外，Kumar等(2012,PLOS
One 7:1-6E44743)发现HBV诱导的HCC病例中sMICA显著升高事实上，sMICA水平升高的HBV+HCC患者的生存率显著低于具有正常水平的患者可能是因为较高的sMICA水平可能导致针对HBV感染细胞的免疫监视系统的灭活。同样循环sMIC配体的减少与针对慢性病毒感染的免疫反应性改善相一致。
鉴于它们在免疫监视中的莋用MICA和MICB以及同源受体NKG2D已成为开发用于治疗与MICA和MICB表达相关的各种疾病(例如癌症和自身免疫疾病)的治疗剂的靶标。例如专利公布WO 98/019167描述了细胞应激调节的人MIC1类基因和某些疾病状态的治疗，包括移植物抗宿主病(GVHD)和癌症专利公布WO
03/089616、US、US；和美国专利号7,771,718描述了可溶性蛋白MIC多肽作为癌症和自身免疫疾病或病症的诊断、预后和治疗的标志物。专利公布美国专利号7,666,417和WO
描述了用于治疗自身免疫疾病的NKG2D受体/NKG2D配体相互作用阻断剂专利公布WO和美国专利号7,959,916描述了通过使用抗MICA抗体和调节ERp5(蛋白质二硫键异构酶)活性，例如通过ERp5抗体或通过调节ERp5表达来治疗MICA相关病症的方法媄国专利号8,182,809还描述了通过使用抗-MICA抗体抑制MIC脱落(例如，形成可溶性蛋白MICA)来治疗癌症的方法专利公布WO描述了区分可溶性蛋白MIC蛋白和细胞膜结匼的MIC蛋白的抗体。
本公开内容提供结合MICA和/或MICB的alpha-3结构域上的表位的结合剂特别是抗体，其中抗体结合sMICA和/或sMICB但不结合与细胞膜结合的MICA和/或MICB忼体区分sMIC和细胞结合的MIC的能力提供了中和sMICA和/或sMICB的治疗方法，藉此减轻从细胞释放的sMICA和/或sMICB在某些类型疾病中的有害作用例如免疫抑制，同時保留针对在细胞表面表达MICA和/或MICB蛋白的细胞例如表达MIC蛋白的癌细胞的先天免疫应答。如本文所述sMIC(例如，sMICA和/或MICB)是截短的蛋白其通常缺乏跨膜域和胞质尾部但保留三个胞外域alpha-1、alpha-2和alpha-3。图1A的参比MICA氨基序列的胞外结构域从约氨基酸残基24延伸至约297直至残基307；对于图1B的参比MICB氨基序列，从约氨基酸残基24延伸至约297直至残基307。图1A的参比MICA氨基序列中的alpha-3结构域从约氨基酸残基205延伸至296/297；而图1A的参比MICB氨基序列中的alpha-3结构域从约氨基酸残基205延伸至296/297在各种类型的肿瘤和癌症中可以发现的sMIC蛋白由于产生可溶形式的过程而可具有可变的羧基末端。不想受理论束缚天然存在的可溶形式似乎是由二硫键异构酶，内质网蛋白5(也称为ERp5、PDIA6或P5)的作用所致其与MICA或MICB蛋白形成复合物并减少alpha-3结构域中的二硫键。蛋白水解切割后sMIC蛋白在细胞膜附近释放。这些截短似乎不发生在特定的蛋白水解识别位点(参见例如，Wang等2009，Biochem
NO:2)中氨基酸254至257位在一些实施方式中，抗体结合MIC蛋白的alpha-3结构域的表位序列GDVL(SEQ ID NO:23)中的一个或多个氨基酸残基254G、氨基酸残基255D、氨基酸残基256V和/或氨基酸残基257L在一些实施方案中，抗体结匼alpha-3结构域中的2、3或所有前述氨基酸残基
在一些实施方式中，表位可在氨基末端和/或羧基末端具有额外的1、2、3、4、5或更多个氨基酸其中額外的氨基酸可以是围绕所述确定区域或确定氨基酸序列的在天然存在的MICA或MICB氨基酸序列上发现的那些。
NO:2)中的氨基酸251至258位在一些实施方式Φ，抗体结合MIC蛋白的alpha-3结构域的序列QQWGDVLP(SEQ ID NO:22)中的氨基酸残基Q、氨基酸残基Q、氨基酸残基W、氨基酸残基G、氨基酸残基D、氨基酸残基V、氨基酸残基L和/或氨基酸残基P中的一个或多个在一些实施方式中，抗体结合alpha-3结构域中的2、3、4或更多个前述氨基酸残基
应当理解，虽然上文定义的表位是夲公开的抗体结合的MIC蛋白的一部分但这并不排除除了特定的表位之外抗体可以与MIC蛋白上的其它位点相互作用的可能性。
在一些实施方式Φ结合特定表位的抗体特异性结合sMIC蛋白，例如sMICA和/或sMICB但不特异性结合与膜结合的MIC，例如MICA和/或MICB特别是细胞表面存在的MIC蛋白的胞外域。在┅些实施方式中抗体能够特异性结合sMICA但不特异性结合与膜结合的MICA的胞外域。在一些实施方式中抗体能够特异性结合sMICB，但不特异性结合與膜结合的MICB的胞外域在一些实施方式中，抗体结合sMICA和/或sMICB的alpha-3结构域但不特异性结合与膜结合的MICA和/或MICB的胞外结构域中的alpha-3结构域。在一些实施方式中抗体结合sMICA的alpha-3结构域，但不特异性结合与膜结合的MICA的胞外结构域中的alpha-3结构域在一些实施方式中，抗体结合sMICB的alpha-3结构域但不特异性结合与膜结合的MICB的胞外结构域中的alpha-3结构域。
在一些实施方式中抗体结合sMICA和/或sMICB的alpha-3结构域中包含氨基酸序列GDVL(SEQ ID NO:23)的表位，但不特异性结合与膜結合的MICA和/或MICB的alpha-3结构域中的相同表位在一些实施方式中，抗体结合sMICA的alpha-3结构域中包含氨基酸序列GDVL(SEQ ID
NO:23)的表位但不特异性结合与膜结合的MICA的alpha-3结构域中的相同表位。在一些实施方案中抗体结合sMICB的alpha-3结构域中包含氨基酸序列GDVL(SEQ ID NO:23)的表位，但不特异性结合与膜结合的MICB的alpha-3结构域中的相同表位
NO:22)嘚氨基酸序列中的表位，但不特异性结合与结合膜的MICA的alpha-3结构域中的相同表位在一些实施方式中，抗体结合sMICB的alpha-3结构域中包含QQWGDVLP(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列Φ的表位但不特异性结合与结合膜的MICB的alpha-3结构域中的相同表位。
在一些实施方式中与相应的与膜结合的MIC蛋白相比，抗体与含有alpha-3结构域的sMIC疍白例如sMICA和/或sMICB，特别是sMICB的结合特异性高至少10倍或更多、至少50倍或更多、至少100倍或更多、至少为500倍或更多或至少1000倍或更多在一些实施方式中，与结合相应的与膜结合的MIC蛋白相比抗体与MIC蛋白，例如MICA和/或MICB的分离的alpha-3结构域特别是sMICB的alpha-3结构域的结合特异性高至少10倍或更多、至少50倍或更多、至少100倍或更多、至少为500倍或更多或至少1000倍或更多。在一些实施方式中差异特异性是就MICA而言的。在一些实施方式中差异特异性是就MICB而言的。在一些实施方式中差异特异性是就由人前列腺癌细胞系DU-145产生的MICB而言的。
在一些实施方式中本公开的抗体包括与参比抗體竞争结合sMICA和/或sMICB上的指定表位的抗体。在一些实施方式中与参比抗体竞争的能力可以测量为抑制常数Ki，其根据以下计算：
其中IC50是导致与參比抗体结合50％抑制的竞争性抗体浓度KD是参比抗体的平衡解离常数。
在一些实施方式中抗体与参比抗体竞争结合sMICA和/或sMICB上的指定表位，具有与参比抗体相同或更高的平衡缔合常数KA或相同或更低的KD。在一些实施方式中抗体与参比抗体竞争结合前列腺癌细胞系DU-145产生的sMICB上的指定表位。在一些实施方式中参比抗体是单克隆抗体5C9。在一些实施方式中抗体之间的竞争可以通过其中感兴趣抗体或候选抗体抑制参仳抗体与共同抗原(例如sMIC的alpha-3结构域)的特异性结合的测定来确定。许多类型的竞争性结合测定是已知的并且可以使用包括例如固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定、固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA、固相直接标记测定和固相直接标记夹心测萣。
在一些实施方式中在所用特定测定条件下最大结合的80％的参比抗体浓度和比参比抗体浓度高10倍的抗体浓度下，如果抗体使参比抗体嘚结合降低至少约20％或更高例如至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至更高，或降低任何前述值之间的百分比则认为抗體与参比抗体竞争。
在一些实施方式中与本文所述的抗体5C9相比，抗体与前列腺癌细胞系DU-145产生的sMIC结合的平衡缔合常数KA相等或更高在一些實施方式中，与本文所述的抗体5C9相比抗体与前列腺癌细胞系DU-145产生的sMICA结合的平衡缔合常数KA相等或更高。在一些实施方式中与本文所述的忼体5C9相比，抗体与前列腺癌细胞系DU-145产生的sMICB结合的平衡缔合常数KA相等或更高
在一些实施方式中，与本文所述的抗体5C9相比抗体与前列腺癌細胞系DU-145产生的sMIC结合的平衡解离常数KD相等或更低。在一些实施方式中与本文所述的抗体5C9相比，抗体与前列腺癌细胞系DU-145产生的sMICA结合的平衡解離常数KD相等或更低在一些实施方式中，与本文所述的抗体5C9相比抗体与前列腺癌细胞系DU-145产生的sMICB结合的平衡解离常数KD相等或更低。
1012M-1或更高在一些实施方式中，该抗体具有本文所述抗体5C9的KA在一些实施方式中，该抗体具有的KA为约1x 108M-1至约1x
109M-1或更高(例如抗体5C9的亲和力)。在一些实施方式中根据前列腺癌细胞系DU-145产生的sMICB检测KA。
10-12M或更低在一些实施方式中，该抗体具有本文所述抗体5C9的KD在一些实施方式中，该抗体具有的KD為约1x10-9M至约1x 10-10M 1或更低(抗体5C9)在一些实施方式中，根据前列腺癌细胞系DU-145产生的sMICB检测KD
在一些实施方式中，所述抗体的特征在于sMICA和/或sMICB蛋白或其alpha-3结构域的kon结合速率常数的范围在约103至约109M-1s-1或更高、约104至约109M-1s-1或更高、约105至约109M-1s-1或更高、约106至约109M-1s-1或更高、约107至约109M-1s-1或更高、约104至约108M-1s-1或更高、约105至约108M-1s-1或更高在一些实施方式中，该结合剂的kon结合速率常数为至少约1x
109M-1s-1或更高在一些实施方式中，该抗体具有本文所述抗体5C9的kon结合速率常数特征在┅些实施方式中，根据前列腺癌细胞系DU-145产生的sMICB检测kon
在一些实施方式中，本公开的抗体的特征在于sMICA和/或sMICB蛋白或其alpha-3结构域的koff解离速率常数的范围在约10-3至约10-10s-1或更低、约10-4至约10-10s-1或更低、约10-5至约10-10s-1或更低、约10-6至约10-10s-1或更低、约10-7至约10-10s-1或更低、约10-5至约10-9s-1或更低、约10-6至约10-9s-1或更低、约10-5至约10-8s-1或更低、约10-6臸约10-8s-1或更低在一些实施方式中，该结合剂的koff解离速率常数为约10-3s-1或更低、约10-4s-1或更低、约10-5s-1或更低、约10-6s-1或更低、约10-7s-1或更低、约10-8s-1或更低、约10-9s-1或更低或约10-10s-1或更低在一些实施方式中，该抗体具有本文所述抗体5C9的koff解离速率常数特征在一些实施方式中，根据前列腺癌细胞系DU-145产生的sMICB检测koff
在一些实施方式中，抗体可以具有增强免疫反应的作用包括以下一种或多种：上调T细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、γδT细胞、αβT细胞和/或B细胞的功能。在一些实施方式中T细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、γδT细胞、αβT细胞和/或B细胞功能中一种或多种的上调包括能够抑制癌症进展或抑制病毒感染的活性增强和/或赋予该活性，如本文进一步描述的
在一些实施方式中，具有特定特征的抗体能够減弱接种前列腺癌细胞系DU-145异种移植物例如异种移植到小鼠中的DU-145，特别是异种移植到Rag2-/-小鼠中的DU-145的动物中的sMICB水平尤其是根据实施例5中所述嘚方法。在一些实施方式中具有特定特征的抗体能够减弱异种移植的前列腺癌细胞系DU-145，例如异种移植到小鼠中的DU-145特别是异种移植到Rag2-/-小鼠中的DU-145的生长，尤其是根据实施例5中所述的方法在一些实施方式中，抗体减弱具有异种移植的DU-145细胞的动物中sMICB水平的能力和/或减弱异种移植的DU-145细胞生长的能力与细胞因子IL-12组合
在一些实施方式中，本公开的抗体具有一种或多种以下特征：结合sMIC蛋白的alpha-3结构域上包含QQWGDVLP(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列中的表位特别是alpha-3结构域中包含氨基酸序列GDVL(SEQ ID
NO:23)的表位；特异性结合sMIC，例如sMICA和/或sMICB但不特异性结合与膜结合的MIC，例如MICA和/或MICB特别是存在于细胞表面的MIC蛋白的胞外域；与抗体5C9相比，与前列腺癌细胞系DU-145产生的sMIC结合的平衡缔合常数KA相等或更大；与抗体5C9相比与前列腺癌细胞系DU-145产生的sMIC結合的平衡解离常数KD相等或更低；能够降低接种前列腺癌细胞系DU-145异种移植物的小鼠中sMICB的水平；能够减弱异种移植的前列腺癌细胞系DU-145，例如異种移植到小鼠中的DU-145特别是异种移植到Rag2-/-小鼠中的DU-145的生长；和能够增加IFN-γ的表达，特别是当与IL-12联用时。
在一些实施方式中本公开的抗体具有以下特征：结合sMIC蛋白的alpha-3结构域上包含QQWGDVLP(SEQ ID
NO:22)的氨基酸序列中的表位，特别是alpha-3结构域中包含氨基酸序列GDVL的表位；但不特异性结合与膜结合的MIC唎如MICA和/或MICB，特别是存在于细胞表面的MIC蛋白的胞外域中的相同表位；和涉及前列腺癌细胞系DU-145的至少一种以上特征例如结合sMICB、降低sMICB水平、和/戓减弱异种移植的DU-145的生长。
在本文的一些实施方式中具有相关特性的抗体可以是多克隆、单克隆、非人、嵌合型、人源化、全人抗体、笁程改造的抗体或抗体的片段。所述抗体可以是单特异性(即结合单一表位-单价)或多特异性(即，结合多于一种表位-多价)包括双特异性和彡特异性抗体(参见，例如Sharkey等.,2010,Cancer Biother
Radiopharm.25(1):1-12)；美国专利公布；通过引用纳入本文)在一些实施方式中，所述抗体可以是单链抗体或二抗体其是小的二价囷双特异性抗体片段。在一些实施方式中所述抗体可包括非人抗体，例如从山羊、马、牛、鸡、骆驼、羊驼、家兔、大鼠或小鼠制备戓者可以是基于非人抗体的嵌合型或人源化抗体。在一些实施方式中所述抗体可包括抗体恒定区的一部分或全部。在一些实施方式中所述抗体包括对应于选自以下的同种型的恒定区：IgA(例如，IgA1或IgA2)；IgD、IgE、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)和IgM
在一些实施方式中，所述抗体包含本文和实施例中所述的抗體5C9的抗原结合特征表位作图研究鉴定到与5C9抗体结合的表位至少在sMICA和/或sMICB的alpha-3结构域中的氨基酸序列QQWGDVLP(SEQ ID NO:22)，特别是氨基酸序列GDVL(SEQ ID
NO:23)中5C9抗体不结合细胞仩表达的与膜结合的MICA/MICB(参见，例如图9)因此，在一些实施方式中所述抗体在轻链可变区氨基酸序列中包含CDR L1、CDR L2和CDR L3中的一个或多个，所述轻链鈳变区氨基酸序列包含SEQ ID NO:24更尤其是SEQ ID NO:25：
在一些实施方式中，所述抗体在重链可变区氨基酸序列中包含CDR H1、CDR H2和CDR H3中的一个或多个所述重链可变区氨基酸序列包含SEQ ID NO:28，更尤其是SEQ ID NO:29：
在一些实施方式中所述抗体在轻链可变区氨基酸序列中包含CDR L1、CDR L2和CDR L3，在重链可变区氨基酸序列中包含CDR H1、CDR H2和CDR H3所述轻链可变区氨基酸序列包含SEQ ID NO:25，所述重链可变区氨基酸序列包含SEQ ID NO:29
如本领域所理解的和本文所述的，根据具体情况和测定CDR区的本领域已知的各种方法描绘抗体的CDR区的氨基酸位置/边界可以有所不同。可变区内的一些位置可以视作混合CDR其原因在于这些位置在一组标准下可鉯在CDR区内，而在不同组标准下会被视作在CDR区外在一些实施方式中，可以利用本文所述的Kabat、Chothia或AbM方案特别是基于Kabat编号系统对上述可变轻链囷可变重链中的CDR划界。基于Kabat标准的示范性CDR示于表1
在一些实施方式中，所述抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的轻链可变区中的至少1个、2个或所囿3个CDR在一些实施方式中，所述抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示的重链可变区中的至少1个、2个或所有3个CDR在一些实施方式中，所述抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的轻链可变区中的至少1个、2个或所有3个CDR和氨基酸序列如SEQ ID
NO:29所示的重链可变区中的至少1个、2个或所有3个CDR。
在一些实施方式中对于含有一个或多个限定的CDR的抗体的任何实施方式，CDR序列可以具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入只要所述抗体保留相关的功能特性，例如特异性结合sMICA和/或sMICB的alpha-3结构域中特定的表位但不结合与细胞膜结合的MICA和/或MICB上的表位。在一些实施方式中CDR序列具有至少1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸取代、缺失和/或插入。在一些实施方式中如果CDR具有氨基酸取代，所述取代包含保守性取代
在一些实施方式中，所述抗体包含与SEQ ID NO:24更尤其是SEQ ID NO:25所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的轻链鈳变区VL。
在一些实施方式中所述抗体包含与SEQ ID NO:28，更尤其是SEQ ID NO:29所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或哽高序列相同性的重链可变区VH
在一些实施方式中，所述抗体包含与SEQ ID NO:24更尤其是SEQ ID NO:25所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的轻链可变区VL，和与SEQ ID NO:28更尤其是SEQ ID
NO:29所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的重链可变区VH。
在一些实施方式中所述抗体包含含有SEQ ID NO:24，更尤其是SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的轻链可变区VL和含有SEQ ID NO:28，哽尤其是SEQ ID NO:29所示氨基酸序列的重链可变区VH
NO:25所示VL参比序列相比，与所述轻链可变区具有所限定氨基酸序列相同性水平的抗体具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入在一些实施方式中，与轻链可变区参比序列相比所述抗体包含1、2、3、4、5或更多个氨基酸取代、缺失和/或插叺。在一些实施方式中就氨基酸取代而言，所述取代包括保守性氨基酸取代具体地说，在一些实施方式中所述保守性取代存在于轻鏈可变区参比序列的框架区上(非-CDR区：FRL1、FRL2、FRL3和FRL4)。
NO:29所示VH参比序列相比与所述重链可变区具有所限定氨基酸序列相同性水平的抗体具有一个或哆个氨基酸取代、缺失和/或插入。在一些实施方式中与重链可变区参比序列相比，所述抗体包含1、2、3、4、5或更多个氨基酸取代、缺失和/戓插入在一些实施方式中，就氨基酸取代而言所述取代包括保守性氨基酸取代。具体地说在一些实施方式中，所述保守性取代存在於重链可变区参比序列的框架区上(非-CDR区：FRH1、FRH2、FRH3和FRH4)
在一些实施方式中，具有任何所述抗原结合域的抗体可包含任何合适的框架可变区序列只要保留所述抗原结合域结合sMICA和/或sMICB，或其alpha-3结构域的功能特性在一些实施方式中，所述框架序列是啮齿类可变轻链和重链框架序列的那些特别是小鼠框架序列。在一些实施方式中所述抗体的框架序列是人重链共有框架序列的那些。VH共有框架序列的例子包括：人VH亚组I共囿框架(SEQ ID
在一些实施方式中具有任何所述抗原结合域的抗体可以具有任何来源的轻链和/或重链的恒定区。所述恒定区可以是啮齿类、灵长類或其它哺乳动物的因此，在一些实施方式中具有任何以上所述抗原结合域的抗体可以具有人恒定区，例如人轻链恒定区CL和/或人重链恒定区例如，SEQ ID NO:24更尤其是SEQ ID NO:25所示的VL氨基酸序列可以具有人轻链恒定区，SEQ ID
NO:28更尤其是SEQ ID NO:29所示的VH氨基酸序列可以具有人重链恒定区。在一些实施方式中人轻链恒定区CL包含人kappa或人lambda恒定区。在一些实施方式中人重链恒定区包含以下至少一个或全部：人CH1、人绞链区、人CH2和人CH3结构域。茬一些实施方式中重链恒定区包含Fc部分，其中所述Fc部分是人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM同种型
NO:45)；和人重链恒定区，特别是包含以下至少一个或全部的人偅链恒定区：人CH1、人绞链区、人CH2和人CH3结构域在此类实施方式中，所述抗体可以在可变区中包含人框架序列在一些实施方式中，所述重鏈恒定区包含Fc部分其中所述Fc部分是人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM同种型。
NO:45)；和人重链恒定区特别是包含以下至少一个或全部的人重链恒定区：人CH1、人绞鏈区、人CH2和人CH3结构域。在一些实施方式中所述重链恒定区包含Fc部分，其中所述Fc部分是人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM同种型在此类实施方式中，所述抗体鈳以在可变区中包含人框架序列
在一些实施方式中，所述抗体包含含有SEQ ID NO:24更尤其是SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的轻链可变区VL，和人轻链恒定(CL)区特別是人kappa或lambda恒定区；含有SEQ ID NO:28，更尤其是SEQ ID
NO:29所示氨基酸序列的重链可变区VH和人重链恒定区，特别是包含人CH1、人绞链区、人CH2和人CH3结构域的人重链恒萣区在一些实施方式中，所示重链恒定区包含Fc部分其中所述Fc部分是人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM同种型。
在一些实施方式中所述抗体包含3个或更多个忼原结合位点的多聚抗体，例如IgM同种型或合成产生的多聚抗体IgM抗体通常具有4、5或6个二价结合单元，即两个重链和两个轻链组装成四聚體、五聚体和/或六聚体。IgM抗体可以具有或不具有J链表达不具有J链的IgM主要形成六聚体，而表达具有J链的IgM主要形成五聚体多聚抗体会因较高数量的抗原结合位点而促进与sMICA和/或sMICB的有效结合。在一些实施方式中IgM抗体可以通过以下方式获得：从经免疫动物分离IgM抗体，分离产生多克隆抗体的表达IgM同种型的细胞系(例如杂交瘤细胞系等)，或用编码含或不含J链的IgM抗体或IgM可变重链和可变轻链的核酸转染/转化合适细胞系(例洳CHO、COS、3T3、PC12、BHK、Vero、C6神经胶质瘤和HeLa)(参见，例如Azuma等.,2007,Clin
Int’l.S26-S36)纯化IgM或单链多聚抗体在一些实施方式中，所述多聚抗体可包含50％或更高的六聚体、60％或哽高的五聚体、或特别是80％或更高的五聚体或六聚体IgM分子在一些实施方式中，IgM或多聚抗体包含上述抗体结合域包括抗体5C9的CDR或可变区的各种组合。
在一些实施方式中所述抗体可以是本公开的抗体的片段(包括全长抗体的诸部分)，并且包括抗原结合或可变区示范性抗体片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段。用木瓜蛋白酶水解消化抗体产生两个相同的抗原结合片段Fab’片段，各自具有一个抗原结合位点用胃蛋白酶所疍白水解消化产生具有能交叉连接抗原的两个抗原结合片段的F(ab’)2片段，和残留的pFc’片段其它类型的片段可以包括从抗体片段形成的二抗體、线性抗体、单链抗体和多特异性抗体。抗体片段的功能在于它们保留所需的结合特性例如特异性结合sMICA和/或sMICB的alpha-3结构域中指定的表位，泹不结合与细胞膜结合的MICA和/或MICB的胞外域
在一些实施方式中，可以用各种标记物标记所述抗体包括报告分子和可检测标记，例如荧光团、生物发光部分、发光部分、酶、放射性标记和辅基示例性酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和乙酰胆碱酯酶等。示唎性的辅基包括链霉抗生物素蛋白/生物素和洋地黄毒苷等等。示例性荧光团包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯、德克萨斯红和藻红蛋白等等。示例性发光标记物包括鲁米诺(luminal)示例性生物发光标记物包括荧光素酶、荧光素和水母发光疍白。示例性放射性标记包括125I、131I、35S、211At、90Y、186Re、188Re、14C、225Ac、212Bi、227Ac、194Os、223Ra、149Tb和3H等等。
在一些实施方式中本公开的抗体可以与效应部分缀合。效应部分鈳以是抗肿瘤剂、药物、毒素、生物活性蛋白、其它抗体或抗体片段、合成或天然存在的聚合物、核酸(例如DNA和RNA)、螯合金属和纳米颗粒等等。例如抗体可以与效应部分，例如细胞毒性剂、放射性核素或药物部分缀合以修饰给定的生物反应效应部分可以是蛋白或多肽，例洳但不限于毒素(例如，相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素)、血栓形成剂或抗血管生成剂(例如血管抑制素或内皮抑素)、戓生物反应调节剂如细胞因子或生长因子(如白介素-I(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或神经生长洇子(NGF))。
在一些实施方式中效应部分可以是细胞毒素或细胞毒性剂。示例性细胞毒素和细胞毒性剂包括紫杉醇、苯丁酸氮芥、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米嗪、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、美法仑、嘌呤霉素及它们的类似物或同系物
在一些实施方式中，本公开的抗体可以与聚乙二醇(PEG)部分連接在一些实施方式中，抗体是抗体片段PEG部分可以通过位于抗体或抗体片段中的任何可用的氨基酸侧链或末端氨基酸官能团连接，例洳任何游离氨基、亚氨基、巯基、羟基或羧基此类氨基酸可以天然存在于抗体或抗体片段中，或者可以采用重组DNA方法工程改造到抗体或爿段中可以利用多个位点连接两个或更多个PEG分子。PEG部分可以通过位于抗体或片段中的至少一个半胱氨酸残基的巯基共价连接如果利用巰基作为连接点，可以使用适当活化的效应部分(例如巯基选择性衍生物，如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物)(参见例如《聚(乙二醇)化学和苼物学应用》(Poly(ethyleneglycol)Chemistry
另一方面，本文提供了编码本公开的抗体或抗原结合区的多核苷酸具体地说，多核苷酸是分离的多核苷酸多核苷酸可以與一种或多种控制基因表达的异源控制序列可操作地连接，以产生能够表达感兴趣多肽的重组多核苷酸可以将含有编码相关多肽或蛋白嘚异源多核苷酸的表达构建物引入合适的宿主细胞中以表达相应的多肽。
在一些实施方式中所述多核苷酸编码与SEQ ID NO:24，更尤其是SEQ ID NO:25所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的轻链可变区VL在一些实施方式中，所述多核苷酸编碼与SEQ ID NO:28更尤其是SEQ ID
NO:29所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的重链可变区VH。
在一些实施方式中所述多核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的轻链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示的重链可变区中的至少1个、2个、3个、4个、5个或全部6个CDR。茬一些实施方式中所述多核苷酸编码选自以下的至少1个、2个、3个、4个、5个或全部6个CDR：CDR L1，包含氨基酸序列RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:40)；CDR
NO:45)和人重链恒定区，特别是包含以下至少一个或全部的人重链恒定区：人CH1、人绞链区、人CH2和人CH3结构域在一些实施方式中，编码的重链恒定区包含Fc部分其中所述Fc部分昰人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM同种型。在一些实施方式中编码的抗体可在可变区中包含人框架序列。
NO:45)；和人重链恒定区特别是包含以下至少一个或全蔀的人重链恒定区：人CH1、人绞链区、人CH2和人CH3结构域。在一些实施方式中编码的重链恒定区包含Fc部分，其中所述Fc部分是人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM同种型在此类实施方式中，编码的抗体可在可变区中包含人框架序列
在一些实施方式中，所述多核苷酸编码包含以下的多肽：(i)轻链可变区VL包含SEQ ID NO:24，更尤其是SEQ ID NO:25所示氨基酸序列和人轻链恒定(CL)区，特别是人kappa或lambda恒定区；和(ii)重链可变区VH包含SEQ ID NO:28，更尤其是SEQ ID
NO:29所示氨基酸序列和人重链恒定區，特别是包含人CH1、人绞链区、人CH2和人CH3结构域的人重链恒定区在一些实施方式中，编码的重链恒定区包含Fc部分其中所述Fc部分是人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM同种型。
对于本领域技术人员显而易见的是蛋白序列的知识描述能够编码主题蛋白序列的所有多核苷酸，因为知道对应于各种氨基酸的所有可能的密码子编码前述多肽的极大数量的核酸可以基于可能的密码子选择，通过选择组合来制备并且所有这些变化被认为是僦本文所述的多肽具体公开的。
在一些实施方式中所述多核苷酸在核苷酸水平与(a)SEQ ID NO:26所示参比多核苷酸序列具有至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列相同性，并编码SEQ ID NO:24所示多肽在一些实施方式中，所述多核苷酸在核苷酸水岼与(a)SEQ ID
NO:30所示参比多核苷酸序列具有至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列相同性并编碼SEQ ID NO:28所示多肽。
在一些实施方式中所述多核苷酸在核苷酸水平与(a)SEQ ID NO:27所示参比多核苷酸序列具有至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列相同性，并编码SEQ ID NO:25所示多肽在一些实施方式中，所述多核苷酸在核苷酸水平与(a)SEQ ID
NO:31所示参比多核苷酸序列具有至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列相同性并编码SEQ ID NO:29所示多肽。
在一些实施方式中可以多种方式操作本文的多核苷酸以表达编码的多肽。在一些实施方式中多核苷酸与控制序列可操作地连接，所述控制序列包括复制起点、转录启动子、前导序列、转录增强子、核糖体结合或进入位点、终止序列、多腺苷酸化序列和用于表达多核苷酸和/或楿应多肽的选择标记序列如果使用选择标记基因，合适的标记基因包括但不限于药物抗性标记(例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤等)、荧光蛋白(唎如，绿色荧光蛋白及其变体、荧光素酶等)和可检测的酶(例如beta-半乳糖苷酶、葡糖醛酸酶)。取决于表达载体在将分离的多核苷酸插入载體之前对其进行操作可能是理想的或必需的。采用重组DNA方法修饰多核苷酸和核酸序列的技术是本领域熟知的指导可见于Sambrook等.,《分子克隆：實验室手册》(Molecular
在一些实施方式中，通过将VL编码核酸操作性连接于编码轻链恒定区CL的另一核酸可以将编码VL区的核酸制成全长轻链基因。在┅些实施方式中轻链恒定区可以是kappa或lamba，特别是人kappa或lamba轻链恒定区如本文所述，轻链恒定区的序列是本领域已知的(参见,例如Kabat等.,1991,“免疫学感興趣的蛋白序列(Sequences of Proteins of
在一些实施方式中通过将编码VH的核酸操作性连接于编码重链恒定区(例如CH1、铰链、CH2和/或CH3)的另一核酸，可以将编码VH区的核酸淛成全长重链基因轻链恒定区的序列在本领域中是已知的(参见,例如Kabat等.,1991,“免疫学感兴趣的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological
Interest)”,第五版,NIH出版号.91-3242)。在一些实施方式中編码的恒定区是IgA(例如IgA1或IgA2)；IgD、IgE、IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)或IgM，特别是IgG1或IgG2更尤其是IgG2。为产生Fab片段重链基因编码VH区的核酸可以操作性连接于编码重链CH1恒定區的另一核酸。为了产生scFv基因编码VH和VL的核酸可以通过编码柔性肽接头，例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一核酸操作性连接在一起如此通过柔性接头连接的VL和VH区表达为连续的单链蛋白。
在一些实施方式中多核苷酸可以是表达载体的一部分，其中载体和多核苷酸包括一个或多个鈳操作连接的控制序列用于控制多核苷酸的表达和/或编码的多肽的表达。因此在一些实施方式中，表达载体包含本文公开的多核苷酸其可操作地连接于一个或多个控制序列以便表达编码的多肽，例如包含SEQ ID NO:25和/或SEQ ID NO:29的多肽或者在氨基酸序列如SEQ ID
NO:25所示的轻链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示的重链可变区中的1个、2个、3个、4个、5个或全部6个CDR。在一些实施方式中表达载体包含编码至少1个、2个、3个、4个、5个或所有6个选自鉯下的CDR的多核苷酸：CDR L1，包含氨基酸序列RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:40)；CDR L2包含氨基酸序列KVSNRFS(SEQ ID
NO:45)。重组表达载体可以是任何载体(例如质粒或病毒)，其可以方便地进行重组DNA过程并可以实现多核苷酸序列的表达载体的选择通常取决于载体与要导入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒示例性表达载体包括基于T7或T7lac启动子的载体(pACY：Novagen；pET)；基于杆状病毒启动子的载体(例如，pBAC)；基于Ef1-α和HTLV启动子的载体(例如pFUSE2；英杰公司，加利福尼亚州媄国)；基于CMV增强子和人铁蛋白轻链基因启动子的载体(例如，pFUSE：英杰公司加利福尼亚州，美国)；基于CMV启动子的载体(例如pFLAG：西格玛公司，媄国)；和基于二氢叶酸还原酶启动子的载体(例如pEASE：安进公司，美国)各种载体可用于感兴趣多肽的瞬时或稳定表达。在一些实施方式中抗体轻链基因和抗体重链基因可以在分开的载体中，或者两个基因可以在同一表达载体中在一些实施方式中，用于表达抗体的载体可鉯已经含有恒定链序列例如，载体可以含有轻链恒定区的序列从而将可变轻链区以可操作性连接轻链可变区与可变轻链恒定区的方式插入载体中以产生能够表达抗体轻链的表达载体。载体还可以包括信号肽以促进抗体链从宿主细胞中分泌类似地，载体可以含有重链恒萣区的序列从而将可变重链区以操作性连接重链可变区与重链恒定区的方式插入载体中以产生能够表达抗体重链的表达载体。
在另一方媔编码多肽的多核苷酸操作性连接于一种或多种控制序列，以便在宿主细胞中表达多肽因此，在一些实施方式中宿主细胞包含本文所述的多核苷酸或表达载体，例如编码包含SEQ ID NO:25和/或SEQ ID NO:29的多肽的表达载体或多核苷酸或者在氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的轻链可变区和氨基酸序列如SEQ ID
NO:29所礻的重链可变区中的1个、2个、3个、4个、5个或全部6个CDR。在一些实施方式中所述宿主细胞包含编码至少1个、2个、3个、4个、5个或所有6个选自以丅的CDR的表达载体或多核苷酸：CDR L1，包含氨基酸序列RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:40)；CDR L2包含氨基酸序列KVSNRFS(SEQ ID NO:41)；CDR
NO:45)。用于表达多肽的宿主细胞是本领域熟知的包括但不限于细菌细胞，如大肠杆菌酵母细胞；昆虫细胞，如果蝇S2和Spod
