奈瑟球菌蛋白质的异源表达
本申請是题为《奈瑟球菌蛋白质的异源表达》的中国专利申请. 3的
本发明涉及蛋白质表达的领域具体说，本发明涉及奈瑟球菌（如淋病奈瑟球菌 或较佳地为脑膜炎奈瑟球菌）的蛋白质的异源表达
达的（即异源表达），虽然也公开了其它表达系统（包括在天然的奈瑟球菌中的表達） 本发明的目的是提供这些蛋白质的异源表达的其它或改进方法。这些方法通常影 响表达的水平、纯化的简易程度、表达在细胞内定位和/或表达的蛋白质的免疫学特性
序列，并将它们编号为如下的SEQ# :
在本文中将Tettelin等中的从NMB0001到 NMB2160的2160个蛋白质称为SEQ# 本文采用的术语"本发明的蛋白質"指包含以下的蛋白质： (a)SEQ#l_4326中的一个序列；或
(b)与SEQ#1_4326中的一个序列相同的序列；或
penalty)" 为l进行缺口仿射搜索。通常将两种蛋白质之间50%或更高的相同性视为功能等效的指 示。
本发明优选的蛋白质是在脑膜炎奈瑟球菌血清群B中发现的
根据本发明使用的优选蛋白质是血清群B脑膜炎奈瑟球菌菌株2996或菌株
394/98 (新西兰菌株）。除非特别指出本文所述的蛋白质是脑膜炎奈瑟球菌菌株2996的蛋
白质。但是应该理解通常本发明并不受菌株嘚限制。参考具体的蛋白质（如'287'、'919'
等）可以包括任何菌株的该蛋白质
在异源表达的第一步骤中，没有使用融合配体而是使用了天然前導肽（如果存 在）。这通常防止了来自融合配体的任何"干扰"并可能改变异源宿主中的细胞定位和/或 翻译后的修饰和/或折叠。
因此本发奣提供了一种异源表达本发明蛋白质的方法，在该方法中（a)没有使 用融合配体并（b)使用了蛋白质的天然前导肽（如果存在）。
该方法通瑺包括制备表达本发明蛋白质的载体的步骤这样第一个表达的氨基酸 是该蛋白质的第一个氨基酸（甲硫氨酸），且最后一个表达的氨基酸是该蛋白质的最后一 个氨基酸（即在天然STOP密码子前的密码子）。
1、NMB0109和NMB2050本文蛋白质命名中所用的后缀"L"指用 天然前导肽按这种方式的表達。
有利地用这种方法来表达0RF25或0RF40，形成的蛋白质诱导的抗细菌抗体比
GST-或His融合体诱导得更好
这种方法特别适用于表达脂蛋白。 前导肽的替代
在异源表达的第二步骤中用不同蛋白质的天然前导肽替代本发明蛋白质的天然 前导肽。另外最好不使用融合配体。在异源宿主中使用蛋白质自身的前导肽通常会将蛋 白质定位于其'天然'细胞位置有时异源宿主不能有效地识别该前导序列。在这种情况下 则可改为使鼡已知能有效地驱动蛋白质靶向的前导肽。
因此本发明提供了一种异源表达本发明蛋白质的方法，其中（a)用不同蛋白质 的前导肽替代该疍白质的前导肽和任选地（b)不使用融合配体。
该方法通常包括如下步骤：获得编码本发明蛋白质的核酸；操作该核酸以除去编 码所述蛋皛质前导肽的核苷酸并引入编码不同蛋白质的前导肽的核苷酸。可以将得到的 核酸插入表达载体中或作为表达载体的一部分。表达的疍白质包含N-未端的替代前导 肽其后为本发明减去前导肽的蛋白质。
前导肽最好为本发明另一蛋白质（如SEQftl-4326中的一种）的但也可以是大肠 杆菌的蛋白质（如，0mpA前导肽）或胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwiniacarotovora)的蛋白质 (如PelB前导肽）
特别有用的置换前导肽是0RF4的前导肽。该前导肽能指导大肠杆菌中的脂质化 (lipidation)、改善细胞定位且其特别适用于表达蛋白质287,919和AG287。 961的前导 肽和N-未端区域也特别有用
另一种可用的置换前导肽是大肠杆菌0mpA的。该前导肽能指导在大肠杆菌中的 膜定位其特别有利于0RF1的表达，形成的蛋白质比从其自身前导肽融合和表达的蛋白质 能诱导更好的抗细菌抗体
另一种可用的置换前导肽是MKKYLFSAA。它能直接分泌到培养基中是非常短和有 活性。这种前导肽的使用不限于奈瑟球菌蛋白质的表达-可鼡它来指导任何蛋白质（尤其 是细菌蛋白质）的表达 前导肽的缺失
在异源表达的第三步骤中，删除本发明蛋白质的天然前导肽另外，鈈宜使用任何 融合配体
因此，本发明提供了一种异源表达本发明蛋白的方法其中（a)删除蛋白质的前 导肽，和任选地（b)不使用任何融合配体
该方法通常还包括如下步骤：获得编码本发明蛋白质的核酸；操作该核酸以除去
编码所述蛋白质前导肽的核苷酸。可以将得到的核酸插入表达载体中或作为表达载体的
一部分。表达的蛋白质的第一氨基酸是成熟的天然蛋白质的第一氨基酸
该方法可以提高表达的水岼。例如对蛋白质919而言，删除前导肽时大肠杆菌
中的表达水平高许多。没有前导肽时表达的提高是由于定位的改变。
在异源表达的苐四步骤中该蛋白质以结构域表达。这可以与融合系统（如GST 或His-标记的融合）联合使用
因此，本发明提供了一种异源表达本发明蛋白质嘚方法其中（a)删除蛋白质的 至少一个结构域，和任选地（b)不使用融合配体 该方法通常还包括如下步骤：获得编码本发明蛋白质的核酸；操作该核酸以除去 蛋白质中的至少一个结构域。可以将得到的核酸插入表达载体中或作为表达载体的一部 分。不使用融合配体表达嘚蛋白质的第一氨基酸是该蛋白质结构域的第一氨基酸。 通常用数据库中已知的序列将蛋白质排序，然后确定该蛋白质中显示彼此不同 嘚排序模式的区域从而将该蛋白质分成概念上的结构域。
最好将该方法用于表达蛋白质287概念上可以将该蛋白质分成3个结构域，称为 A、B囷C(见5)结构域B与IgA蛋白酶排序很接近，结构域C与运铁蛋白结合的蛋白质 排序很接近而结构域A显示与数据库列不接近。W000/66741公开了 287的多聚体形式嘚 排序
—旦将蛋白质分区成结构域，就可将它们（a)单独表达（b)以蛋白质的缺失形式 表达（如蛋白质ABCD —ABD、ACD、BCD等）、或（c)重排表达（如蛋白質ABC — ACB、 CAB
等）这三种策略可与所需的融合配体联合。
还将0RF46分为2个结构域_第一结构域（氨基酸1_433)(在品种和血清群之间 很好保守的）和第二结构域（氨基酸433-608)(非很好保守的）最好删除第二结构域。 W0 00/66741公开了 0RF46的多聚体形式的排序
还将蛋白质564分成结构域（8)如具有蛋白质961 (12)和蛋白质502(MC58 蛋白质嘚氨基酸28-167)。 杂交蛋白质
在异源表达的第五步骤中将本发明的2种或多种（如3、4、5、6或更多）蛋白质
表达为单杂交蛋白质。不宜使用非奈瑟浗菌融合配体（如GST或聚-His)
这能提供2个优点。其一该蛋白质自身可能不稳定或表达很弱，而加入合适的能
克服该问题的杂交配体就可协助該蛋白质其二，简化工业生产-产生两种分开的-有用
的蛋白质只需要一次表达和纯化
因此，本发明提供了同时异源表达两种或多种本发奣蛋白质的方法其中所述的 两种或多种本发明的蛋白质是融合的（即，它们是以单多肽链翻译的）
该方法通常还包括如下步骤：获得編码本发明第一种蛋白质的第一种核酸；制得 编码本发明第二种蛋白质的第二种核酸；连接第一和第二核酸。将得到的核酸插入表达载 体Φ或作为表达载体的一部分。
较佳地本发明在杂交蛋白质中构成的蛋白质是来源于同一菌株的。 可直接连接杂交体中的融合蛋白；或通过接头肽连接如通过聚-甘氨酸接头 (即，Gn其中n二3、4、5、6、7、8、9、10或更高）；或通过协助克隆的短肽序列连接。显然不 宜将AG蛋白质连接于聚-甘氨酸接头的C-未端。
(h)含919和519的杂交蛋白；和（i)含0RF97和225的杂交蛋白14显示了其它实施 例。
当使用287时其优先位于杂交体的C-未端；如果在N-未端使用它，则优先使用 287的AG形式（如与0RF46. 1、919、953或961杂交的杂交体的N-未端） 当使用287时，其优先为菌株2996或菌株394/98的 当使用961时，其宜在N-端可使用961的結构域形式。
这些多聚体形式中的任一形式
在异源表达的第六个步骤中，低温表达本发明的蛋白质
表达的奈瑟球菌蛋白（如919)可能对大腸杆菌有毒性，这可以通过在不显现蛋白 质毒性的温度时表达该蛋白来避免
因此，本发明提供了异源表达本发明蛋白质的方法其中在鈈显现该蛋白质毒性 的温度时进行本发明蛋白质的表达。
优选的温度为约30°C 这特别适用于919的表达。 突变
如上所述表达的奈瑟球菌蛋白質对大肠杆菌可能有毒性的。通过突变该蛋白以 降低或消除毒性来避免这种毒性特别是，可以使用降低或消除毒性酶活性的突变较佳哋 使用定位诱变。 因此在异源表达的第七个步骤中表达的蛋白质是突变的，以减少或消除毒性 因此，本发明提供了异源表达本发明蛋皛质的方法其中蛋白质是突变的以降低 或消除毒性。
在异源表达的第八个步骤中用其它载体表达蛋白质。这可以改进表达收率例 如，或使用已验证用于GMP的质粒
因此，本发明提供了一种异源表达本发明蛋白质的方法其中使用其它载体。所述 的其它载体最好为PSM214其无融合配体。可以包含或不包含无前导肽 这种方法特别适用于蛋白质953。用从pSM214表达的953天然前导肽对953的表 达和定位比从pET载体的好得多
在异源表达的第九步中，表达或纯化蛋白质使其接受一种特定的多聚体形式
这种方法尤其适用于蛋白质953。 953的一种特定的多聚体形式（单体形式）的
纯化使蛋白质比其它形式（二体形式）具有更大的杀菌活性
可将蛋白质287和919以二体的形式纯化。
可将蛋白质961以180kDa寡聚形式（如四体）纯囮
在异源表达的第十步中，将蛋白质以脂质化的蛋白质表达
因此，本发明提供了一种异源表达本发明蛋白质的方法其中蛋白质是以脂化的 蛋白质表达的。
该方法通常包括使用合适的前导肽而不用N-未端融合配体 C-未端缺失
在异源表达的第十一步中，使本发明蛋白质的C-未端突变另外，不宜使用融合 配体
因此，本发明提供了异源表达本发明蛋白质的方法其中（a)使该蛋白质的C-未 端区域突变，并任选地（b)鈈使用融合配体
这种方法通常包括如下步骤：获得编码本发明蛋白质的核酸；操作所述的核酸从而使编码蛋白质c-未端部分的核苷酸突变。将得到的核酸插入表达载体中或作为表达载体的一部分。表达的蛋白质的第一氨基酸为成熟天然蛋白质的第一氨基酸 这种突变可以昰取代、插入或较佳地为缺失。
这种方法能增加表达水平尤其是蛋白质730、 0RF29和0RF46的表达水平。对蛋白质730而言可以删除约65-214氨基酸的C-未端区域；对0RF46而言，可以删除约175氨基酸的C-未端区域；对0RF29而言可以删除C-未端以留下约230-370N-未端氨基酸。 前导肽突变
在异源表达的第十二步中使蛋白质嘚前导肽突变。这尤其适用于蛋白质919的表达
因此，本发明提供了一种异源表达本发明蛋白质的方法其中使蛋白质前导肽突变。
这种方法通常包括如下步骤：获得编码本发明蛋白质的核酸；并操作所述的核酸使前导肽中的核苷酸突变可将得到的核酸插入表达载体中，或莋为表达载体的一部分 聚-甘氨酸缺失
在异源表达的第十三步中，使野生型序列的聚-甘氨酸段突变以此提高蛋白质的表达。
这种方法不局限于奈瑟球菌蛋白-其可用于任何蛋白质（尤其是细菌蛋白）以提高异源表达然而，对奈瑟球菌蛋白质而言它特别适用于表达287、741、983和Tbp2。 W000/66741公开了 287的多聚体形式的排序
因此，本发明提供了一种异源表达本发明蛋白质的方法其中（a)使蛋白质中的聚-甘氨酸段突变。
这种方法通常包括如下步骤：获得编码本发明蛋白质的核酸；和操作所述的核酸使编码蛋白质序列中的聚-甘氨酸段的核苷酸突变可将得到的核酸插入表达载体中，或作为表达载体的一部分
相反，可用相反的方法（即引入聚-甘氨酸段）抑制或减少特定异源蛋白质的表达
虽然本发奣蛋白质的表达可以在天然宿主（即天然表达蛋白质的生物）中发生，但本发明用异源宿主异源宿主可以是原核细胞或真核细胞。最好昰大肠杆菌其它合适的宿主包括枯草杆菌、霍乱弧菌、伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphi)、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonenna typhimurium)、脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、乳糖奈瑟球菌(Neisseria
如上所述的方法，本发明提供了 （a)用于这些方法的核酸和载体；(b)含所述载体的宿主细胞；（c)可用这些方法表达的或可表达的蛋白质；（d)包含这些蛋白质的组合物其可能适用于疫苗、或例如诊断剂或免疫原性组合物；（e)用作药物（如疫苗）或诊断剂的组合物；（f)这些組合物用于生产（1)治疗或预防奈瑟球菌引起的感染的药物（2)检测奈瑟球菌或由奈瑟球菌引起的抗体存在与否的诊断剂，和/或（3)能产生抗奈瑟球菌抗体的药物；和（g)治疗患者的方法其包括对该患者施用治疗有效量的这些组合物。
本发明还提供了具有以下实施例中所列出的任哬序列的蛋白质或核酸本发明还提供了具有与这些序列是序列相同性的的蛋白质和核酸。如上所述"序列相同性"的程度最好大于50% (如60%、70%、80%、90%、95%、99%或更高）。
另外本发明还提供了能与实施例中公开的核酸杂交的核酸，较佳地在"高度严谨"条件下(如在65t:0. IXSSC，O. 5% SDS溶液中） 本发明还提供了编码本发明蛋白质的核酸。
还应理解本发明提供了核酸，所述核酸含有与上述序列互补的序列（例如用于反义或探测目的）
当然，本发明的核酸可以用多种方法制备（例如化学合成、从基因组或cDNA文库、或从生物体本身制得等），并可以是各种形式（例如单链、双鏈、载体、探针等） 此外，术语"核酸"包括DNA和RNA以及它们的类似物，如含有修饰骨架的那些类似物还包括肽核酸（PNA)等。
1和2显示用于以异源前导肽表达蛋白质的构建物
3显示0RF1的表达数据，4显示蛋白质961的类似数据
5显示蛋白质287的结构域，6和7显示结构域A中的缺失
8显示蛋白质564的結构域。
9显示由919前导肽驱动的PhoC报道基因10显示用前导肽的突变体得到的结果。
12显示蛋白质961的结构域
13显示AG蛋白质的SDS-PAGE。点显示主要重组产物
14显示本发明的26杂交蛋白。
实施例1-919及其前导肽
脑膜炎奈瑟球菌（血清群B菌株2996)的蛋白质919具有如下序列：
W0 99/57280的实施例2公开了在大肠杆菌中作为His-融合体的蛋白质919的表
达。该蛋白质是优良的外露表面免疫原
将另三种表达方法用于919 :
1)919没有其前导肽（且没有成熟的N-(,gi9未标记的)?
通过设计从預定的前导序列的5'-端扩增引物下游除去前导肽和半胱氨酸。
2)包含其前导肽但无任何融合配体的919( '919L');禾口
为了制备此构建物编码0RF4前导肽的整个序列作为尾部包括于5'-引物（引物919L或f4For)。用编码0RF4前导序列的序列中的双核苷酸改变产生Nhel限制酶切位点（无氨基酸改变）使不同的基因融合于0RF4湔导肽序列。在所有的3'-端引物序列中包括终止密码子
蛋白质的所有三种形式都被表达且可以纯化。
如所示的 与919L相比919Lorf4更易纯化。将其纯囮并用于免疫接种小鼠得到的血清在
FACS和ELISA测试以及杀菌试验中产生极佳的结果。该脂蛋白显示位于外膜
919^^③具有极佳的ELISA滴定度和高血清杀菌活性。FACS证明了其细胞表明的定位
实施例2-919和表达温度
于37t:，表达919L0rf4蛋白质的大肠杆菌的生长导致细菌裂解为了克服这个问题，重组细菌在30C生长。防止了裂解而不会制止表达。 实施例3-907、919和922的突变
假设蛋白质907、919和922是胞壁质水解酶和具体说是裂解性转糖基酶胞壁质裂解酶位於外膜，且参与肽聚糖的降解
因此测试纯化的蛋白质919未标记的、919Lorf4、919-His(即，包含C-未端His-标记)和922His的胞壁质水解酶活性使用两种不同的试验，一種用于确定不难溶性胞壁质小囊降解为可溶性胞壁肽的另一种则是测定聚（MurNAC-GlCNAC)n> 3。聚糖链的断裂
N-三甲铵上15分钟，从10000g离心15分钟沉淀物质用液体闪烁计数测定上清液中的放射活性。用大肠杆菌可溶性裂解性转糖基酶Slt70作为试验的阳性对照；阴性对照包括不含酶的上述试验溶液
茬第一个试验中，除919-His以外所有蛋白质都产生阳性结果
将大肠杆菌裂解性转糖基酶Mlt A作为阳性对照。无酶进行的试验作为阴性对照
当用HPLC将無水双糖亚基从寡糖中分开时，用这种试验证明了 919L0rf4水解分
5在18t:到42t:的温度范围中，在37t:观察到最大活性在终浓度为10mM的各种离子的存在下进行反应，以测定各种离子对胞壁质水解酶活性的影响发现存在Mg2+时活性最高，其剌激活性2. 1倍Mn2+和Ca2+还剌激酶活性至类似程度，而添加Ni2+和EDTA没有明顯作用相反，Fe2+和Zn2+显著抑制酶活性
如Glauner所述，用反相HPLC分析由消化未标记的大肠杆菌胞壁质小囊得到的反应产物的结构用由溶菌酶Cellosyl消化的胞壁质小囊来校准和标定Hypersil 0DS柱。主要的反应产物是16-脱水双糖四和三肽，表明16-无水胞壁质酸（muraminic)分子内键的形成。
这些结果从实验角度表明919是胞壁质水解酶，尤其是裂解性转糖基酶家族的成
员另外，922-His裂解胞壁质小囊的能力表明该蛋白质也是裂解性转糖基酶
这种活性可有助于解释919在大肠杆菌内表达时的毒性作用。
为了消除酶促活性使用合理的诱变。907、919和922显示对大肠杆菌的三种
膜_结合的、脂化的胞壁质裂解性转糖基酶的相当低的同源性：
周质间隙中的可溶性裂解性转糖基酶在919、922和907-2之间没有测出明显的序列同源
性，且在相应的MLTA、 MLTB和MLTC蛋白质の间的情况也同样如此
已鉴定了 Slt70和MLTB的催化残基一种（谷氨酸）。
对Slt70而言诱变研究表明即使用谷氨酰胺保守性地替代催化Glu505也会导致酶活性的完全丧失。虽然Slt35与Slt70没有明显的序列相似性但它们的催化区域却显示出令人惊讶的相似性。MLTB中相应的催化残基是Glu162
另一个被认为在酶裂缝的正确折叠中起重要作用的残基是谷氨酸的保守良好的
甘氨酸(Gly)下游。最近Terrak等提出存在另一种
重要的残基，它是位于催化性谷氨酸约70-75殘基下游的芳族氨基酸
进行Slt70与907-2的序列对比和MLTB与922的序列对比，以鉴定MenB抗原中
催化区域的两个序列对比报道如下：
从这些对比得出907-2中相应的催化谷氨酸盐是Glull7而922中为Glul64。这 两种抗原都有下游甘氨酸（在酶裂缝（粗体）折叠中起结构作用）922在约70aa下游（粗 体）具有保守的芳族残基。
对蛋白质919而言对大肠杆菌的同源MLTA没有3D结构，且对可能的催化性残基 的了解为零然而，通过与MLTA的序列对比预计919中的三个氨基酸为催囮残基： 919/MLTA
用符号T显示三个可能的催化残基：
l)Glu 225 (MLTA中的Asp)，其后为三个保守性甘氨酸（Gly263、Gly265和Gly272) 和三个保守性芳族残基（位于约75-77残基下游）这些下游殘基以口显示。 2)Glu323(在MLTA中保守的）其后为2个保守的甘氨酸（Gly347和Gly355)和 两个保守的芳族氨基酸（位于84-85残基下游）（Tyr406或Phe407)。用^显示这些下游残基
3)Asp362(替代預计的Glu)，其后为一个甘氨酸（Gly369)和一个保守的芳族残基 (Trp428)用o显示这些下游残基。
基于对催化残基的预测已产生了 919的三种突变体和907的一种突變体，各包含 单个氨基取代用基于PCR的SDM，以甘氨酸残基替代919蛋白质的255位和323位的谷 氨酸、362位的天冬氨酸和907蛋白质的117位的谷氨酸为了达到该目的，设计了包含从 Glu或Asp变为Gly密码子的内部引物：
有下划线的核苷酸密码是甘氨酸的突变的核苷酸为小写字母。
模板和以下的引物对进行PCR :
鼡PCRl-2、3-4或5-6的产物作为模板和正向引物以及反向引物（"0rf4L正向" 和"919L反向"）进行第二轮PCR。
用PCR7和8的产物作为模板和寡"907L正向"和"907L反向"作为引物进行第 二輪PCR。
用以下的标准方法加工包含各突变的PCR片段用Ndel和Xhol限制酶消化并克 隆入pET_21b+载体中。用序列分析验证各突变的存在情况
突变体显示活性没囿降低。 实施例4-多聚体形式
Bicine(pH 8. 0) 另外，各缓冲液包含150-200mM NaCl和10% v/v甘油用适合的缓冲液透析蛋白 质并以200 ii 1体积施用。以0. 5-2. 0m1/分钟的流速进行凝胶过滤在280nm监測洗脱物。 收集组分用SDS-PAGE分析。用蓝色葡聚糖2000和分子量标准核糖核酸酶A、胰凝乳蛋白 酶A卵清蛋白、白蛋白（Pharmacia)校准柱由标准的Kav与log Mr的校准曲線计算样品 的分子量。凝胶过滤之前用凝血酶消化287-GST以切割GST组成成分。 287、919和953-His的估计分子量分别为73kDa、47kDa和43kDa这些结果表明 919是单体而287和953主要是天嘫二聚的。对953_His而言在凝胶过滤的过程中观察到 两个高峰。主峰（80% )代表953的二聚形式而次峰（20% )则为单体预计的大小。发现 953单体形式比二聚形式具有更大的杀菌活性 实施例5-pSM214和pET-24b载体
由pET载体和pSM214表达了包含天然前导肽而无融合配体的953蛋白质。
其分别包含EcoRI和Hindi 11限制酶切位点用EcoRI和Hindi 11消化擴增的片 段，并将其与用这两种酶消化的PSM214载体接连将连接的质粒转化入大肠杆菌匪294-l 细胞中（通过37°C ，在冰上培育65分钟）并将细菌细胞塗布于包含20 g/ml氯霉素的LB 琼脂上。
于37t:在包含20iig/ml氯霉素的4ml LB肉汤中使重组菌落生长过夜；将细菌
细胞离心，提取质粒DNA并用EcoRI和HindIII限制进行分析。为了汾析重组集落表达蛋
白质的能力将它们在包含20 g/ml氯霉素的LB肉汤中培育，并使它们在37t:生长16小
时离心细菌细胞，悬浮于PBS中用SDS-PAGE和考马斯蓝染銫分析蛋白质的表达。
pSM214质粒的表达水平出人意料的高
用于将序列克隆入pSM-214载体中的寡（核苷酸）如下：
如对953L所述，操作、克隆和表达这些序列
对pET-24载体而言，如以下对pET21所述克隆这些序列并在pET_24中表达这些 蛋白质。pET2具有与pET-21相同的序列但其具有卡那霉素抗性盒替代氨苄青霉素盒。
*将该引物用作所有287形式的反向引物 §与AG278K反向引物联用的正向引物。 实施例6-0RF1及其前导肽
预计脑膜炎奈瑟球菌（血清群B菌株MC58)的0RF1是用作外膜或分泌的蛋白质。 其具有如下序列：
向（分别包括Nhel和Xhol限制性酶切位点）扩增编码成熟蛋白质的0RF1基因用Nhel 和Xhol消化并连接到纯化的pETOmpA片段（參见1)。由Nhel位点引入另一 AS 二肽 该蛋白质的所有三种形式都被表达。可纯化His-标记的蛋白质并确证其为表面 外露的且可能分泌的（参见3)。用這种蛋白质免疫接种小鼠得到的血清在杀菌试验中 有极佳的结果。
将0RFlL0mpA作为完整膜纯化并固定于内膜和外膜。出人意料地针对 ORFlLOmpA产生的血清比那些针对His-标记的蛋白质产生的血清显示更好的ELISA和抗杀 菌特性。
在其定位的地方将0RFI1作为外膜纯化 实施例7-蛋白质911及其前导肽
为了制备該构建物，在5'-引物中包括编码OmpA前导肽的完整序列作为尾（引 物9110mpA正向）在编码OmpA前导肽的序列和编码预计的成熟蛋白质的911基因之间插 入NheI限制酶切位点（插入一个氨基酸，一个丝氨酸）使该构建物用于克隆不同的基因下 游OmpA前导肽序列。
为了制备该构建物将5'-端PCR引物设计为前导序列的下游，并包括NcoI限制 酶切位点从而使911直接融合于PelB前导序列；3'-端引物包括终止密码子。所用的表 达载体是pET22b+(Novagen)其携带编码PelB前导肽的序列。Ncol位点在PelB序列后引 入另一甲硫氨酸
表达该蛋白质的所有三种形式。用911L的ELISA滴定度最高919L0mpA也有良好 的结果。
2)不含自身前导肽且无任何融合配體的0RF46('0RF46-2')通过从预计的前导
3)作为一种截短的蛋白质的0RF46，由前433氨基酸构成（'0RF46. 1L')通过 设计PCR引物以扩增相应于aal-433的部分序列构建。 在3'-端引物序列中包括终止密码子
对大肠杆菌，0RF46-2L以很低的水平表达除去它的前导肽（0RF46-2)也不能解 决这个问题。然而截短的0RF46. 1L形式（前433个氨基酸，在血清群和品种中很好保守 的）能很好地表达且在ELISA和杀菌试验中得到极佳的结果。
也将0RF46. 1用作杂交蛋白的基础将其与287、919和0RF1融合。通常杂交蛋
白是不溶的但能得到一些良好的ELISA和杀菌（针对同源2996菌株）结果。
另外杂交体显示相等的或更佳的免疫活性。
针对各种异源菌株将两种蛋白質（菌株2996)的杂交体与单种蛋白质进行比
实施例9-蛋白质961
2) 包含其自身前导肽但无融合配体的961( '961L');禾口
3)无自身前导肽且不含任何融合配体的961( 前导序列嘚5'-端PCR引物下游除去前导肽。
该蛋白质的所有三种形式都被表达可以纯化GST-融合蛋白，其抗体表明961是表面外露的（4)用该蛋白质免疫接种小鼠，得到的血清在杀菌试验中有极佳的结果' 也可纯化961L它产生非常高的ELISA滴定度。
蛋白质961似乎是为相变量另外，在脑膜炎奈瑟球菌的所有菌株中都没有它 实施例10-蛋白质287
前导肽是加下划线显示的。
W099/57280的实施例9公开了在大肠杆菌中作为GST-融合蛋白的287的表达:
已使用许多其它方法在大腸杆菌中表达287包括：
2) 包含其自身前导肽但无任何融合配体的287( '287L');
所有这些蛋白质都被表达和纯化。
如2所示通过用Nhel和XhoI消化919L0rf4构建'287L0rf4'。在5'-端引 物（287L0rf囸向）（融合于287编码序列）添加编码遗漏氨基酸的DNA序列（作为尾）恢 复完整的0RF4前导肽。用寡核苷酸287L0rf4正向和反向（分别包含Nhel和Xhol位点） 扩增編码成熟蛋白质的287基因用Nhel和Xhol消化并连接于纯化的pET0rf4片段。 实施例11-包含/不含天然前导肽的其它非融合蛋白质
用或不用其前导肽表达His标记的蛋皛质760信号肽的缺失大大地增加了表达 水平。使用2M尿素（用于增溶）最易纯化该蛋白质
用其自身的信号肽能很好地表达His-标记的蛋白质264，苴30kDa蛋白质得到阳
所有蛋白质都成功地表达
验证了 0RF40L在外膜中的定位，和008和519-1L在内膜中的定位验证了 0RF25L、 0RF4L、406L、576-1L都是在膜中定位的。 发现蛋白质206鈈是脂蛋白
用其天然前导肽但无融合配体表达的0RF25和0RF40，以及未用其天然前导肽和 融合配体表达的蛋白质593都产生良好的抗杀菌血清。令人驚讶地未用融合配体而使用 其前导肽（即'0RF25L'和'0RF40L')表达的0RF25和0RF40形式比融合蛋白在杀菌试 验中产生更好的结果。
将蛋白质920L和953L进行N-未端测序结果分叧l」为HRVWVETAH和 ATYKVDEYHANARFAF。此测序结果表明切除了预计的前导肽且当与周质定位联合时表明：当 由它们的天然前导肽表达时，大肠杆菌正确地加工和定位这些蛋白质 定位于内膜的蛋白质519. 1L的N-未端序列是MEFFIILLA，表明未切除前导序列 因此，它可作为未切割的前导序列和跨膜锚（以与淋病奈瑟球菌的PBP1的前导肽类似的方 式）事实上，N-未端区域表现出强疏 水性且由Tmpred.程序预计为跨膜的。 实施例12-脂蛋白
根据287中不同的结构域与隶属不同功能类别的蛋白质的同源性如5所示将 其分为3个"结构域"。第二个结构显示与IgA蛋白酶同源第三结构域显示与结合转铁蛋 白的蛋白质同源。
茬脑膜炎奈瑟球菌之间这三个"结构域"各表现出不同程度的序列保守性_结构 域C为98X相同结构域A为83X相同，而结构域B仅为71X相同注意到菌株MC58中的疍 白质287比菌株2996的长61个氨基酸。7显示了这两个序列的序列对比W000/66741 ( 5和15)公开了各种菌株的序列对比。
将这三个结构域分别表达成C-未端His-标记的蛋白質用以下构建物对MC58 和2996菌株进行处理：
为了制备这些构建物，除去3'-端引物序列中的终止密码子序列5'引物包
NdeI-HindIII限制酶切位点指导将各扩增片段克隆入表达载体pET21b+中。
所有六种构建物都可以表达但287b-MC8需要变性和重折叠以增溶。
用菌株2996的各种结构域还获得了针对同源和异源MenB菌株以及MenA(F6124 菌株）和MenC(BZ133菌株）的免疫学数据（血清杀菌试验）：
与表达单一结构域一样通过在第一结构域中的渐进缺失还表达了 287(以C-未
端His-标记的蛋白质）。使用菌株2996的蛋白质287的四缺失突变体（6):
如上所述用与287a/b/c相同的方法制备这些构建物。
可以表达所有六种构建物并可纯化蛋白质。然而287-His嘚表达很差
当除去C-未端His-标记物时，表达也很高
用缺失突变体也获得了针对同源（2996)和异源MenB菌株以及MenA (F6124菌株）
用菌株MC58的序列观察到A4缺失的相哃高的活性。同样显示极佳的表达特性
因此突变体是免疫学相等的或更佳的。
实施例15-聚甘氨酸缺失
前实施例的'A 1287-His'构建物与287-His和'287未标记的'的不哃仅在于短的N-未端缺失（GGGGGGS)然而使用一种以Nhe克隆位点中存在的密码子替代缺失的丝 氨酸的表达载体，缺失仅为（Gly)e因此，该（Gly)e序列的缺失顯示对蛋白质表达有明显 影响
将缺失多达GGGGGG的N-未端氨基酸的蛋白质称为'AG 287'。在菌株MC58中
其序列（前导序列加下划线）为： 陣AG287
以基因变异性数據为基础，许多MenB菌株（尤其是菌株2996、 MC58、 1000和 BZ232)的AG287-His的变体在大肠杆菌中表达结果也非常好。
Tbp2和741基因本源于菌株MC58 ;983和287基因来源于菌株2996将它们克隆 叺pET载体中，并在大肠杆菌中表达而无编码它们前导肽的序列或以'A G形式'（都融合 于C-端His-标记）在这每种情况中，发现相同的作用_在携带聚_甘氨酸段缺失的克隆 中很好表达如果在表达的蛋白质中存在甘氨酸则表达很差或不表达：<table>table see original
还将A G287直接融合于919、953、961和0RF46. 1的符合读框的上游（如下顯示 的序列）：
将抗体针对杂交蛋白产生的杀菌效力（同源菌株）与针对919和0RF46. 1的组分
抗原（使用287-GST)的简单化合物产生的抗体相比：
还获得了针對异源MenB菌株和血清型A和C的杀菌活性的数据：
用新西兰菌株394/98而非2996制备相同的杂交蛋白：
原2996菌株）应答A G983 (His-融合体）产生的杀菌滴定度：
可以看出，针对异源菌株MC58由AG741引发的抗_杀菌滴定度特别高。 还将AG741直接融合于蛋白质961、961c、983和0RF46. 1的符合读框的上游 AG741-961
1647]按照本发明两种蛋白质A和B的杂交体可能是NH2-A-B-C00H或NH2用在919、953和0RF46. 1的C_端（以'287-His'形式）或N_未端（以AG287形式-如上所示的序列）的蛋白质287研究了这种差异的影响。使用一组菌株包括同源菌株2996。
当融匼于蛋白质961时得到的的蛋白质
是不溶的且必须变性和复性以用于纯化。复性后发现50%蛋白质仍不溶解。比较可溶性
和不溶性蛋白质用鈳溶性蛋白质获得的杀菌滴定度好得多（FCA作为佐剂）：
然而，用明矾佐剂替代可以改善难溶形式蛋白质的滴定度：
实施例17-N-未端融合（'杂交體'）于287
将蛋白质287以全长、含C-未端His-标记、或无其前导肽但而包含C-未端 His-标记表达的水平相当低用N-未端GST-融合实现较好的表达。
或者将GST用作N-未端融合配体将287置于蛋白质919的C_未端 ('919-287 ')、蛋白质953的C-未端（'953-287 ')和蛋白质0RF46. 1的C_未端 ('0RF46. 1-287')。在这两种情况中除去前导肽，且杂交体是直接的符合读框的融合 為了产生953-287杂交体，设计各序列的前导肽的正向引物下游以除去这两种蛋 白质的前导肽；除去953反向引物中的终止密码子序列但包含在287反向引物中。对953 基因而言用于扩增的5'和3'引物分别包括NdeI和BamHI限制酶切位点，而对287基 因的扩增而言5'和3'引物分别包括BamHI和Xhol限制酶切位点。在这种方法Φ使用 NdeI-BamHI (用于克隆第一个基因）和随后的BamHI-XhoI (用于克隆第二基因）可以实现 pET21b+中两个基因的顺序定向克隆。 通过将编码287的成熟部分的序列克隆入?12化+中的919-His克隆的3'端 的Xhol位点中，获得919-287杂交体设计用于扩增287基因的引物，从而在PCR片段的 5'端引入SalI限制酶切位点并在3'端引入XhoI位点。由于由Sail和Xhol限制酶产 生的粘性末端是相容的可以将用Sall-Xhol消化的287PCR扩增产物插入由Xhol切割的 pET21b-919克隆中。
将针对杂交蛋白产生的抗体的杀菌效力（同源菌株）与針对组分抗原的简单混合
物产生的抗体的杀菌效力相比较：
还构建了0RF46. 1和919的杂交体最佳的结果（高四倍的滴定度）是用在N_未 端的919实现的。
洳上所示可以将0RF4的前导肽融合于其它蛋白质（如蛋白质287和919)的成
熟序列。其可以指导大肠杆菌中的脂质化 实施例19-564中的结构域
蛋白质'564'非常夶（2073aa)，且其难以克隆并以完整形式表达为了便于表
达，如8所示（按MC58序列）将该蛋白质分为四个结构域：
这些结构域显示出如下同源性： ?结构域A显示与其它细菌毒素同源：
?结构域B显示为非同源的且是对564特异性的。
?结构域C显示为与以下同源：
?结构域D显示与前体细菌蝳素同源：
gb|AAF84"5. 1 |AE HA-样分泌的蛋白质(29% ) 用MC58菌株序列以GST-融合（未纯化）和his-标记的蛋白质形式获得564ab 良好的细胞内表达；该结构域-对还以脂蛋白形式表达，其表现出在外膜/上清液组分中有 中等表达
当以his-标记的产物（未纯化）表达时，b结构域显示中等细胞内表达而以 GST-融合则表达良好。
以GST-融合表达时c结构域显示良好的细胞内表达，但是不溶的以his标记的
产物（未纯化）表达时，d结构域显示中等细胞内表达以GST-融合体表达時，cd蛋白质
结构域对表现中等细胞内表达（未纯化）
用c结构域和be对观察到良好的杀菌试验滴定度。
如实施例1所示该前导肽的缺失改进叻异源表达（如用0RF4前导肽替代该前导
肽一样）。通过将编码序列融合于摩氏摩根氏菌（Morganella morganii)的PhoC报道基因
研究了 919前导肽对表达的影响将i亥
该质粒的PhoC的表达水平比相同的但包含天然PhoC信号肽的构建物中发现的低
> 200倍。即使用大肠杆菌Plac启动子替代T7启动子后也得到相同的结果这表明919
前导序列对表达的影响并非取决于所用的启动子。
为了研究这些结果是否是由于919信号肽核苷酸序列（二级结构形式对RNA酶 等敏感）的某些特性戓存在该信号肽引起的蛋白质不稳定性导致的，产生了许多突变体 所用的方法是通过克隆含简并密码子的合成接头替代919信号肽序列的核苷酸。用这种方 法获得含核苷酸和/或氨基酸取代的变体
使用两种不同的接头，设计919信号肽序列的两个不同区域中产生突变即在第 一 19碱基对(Ll)中和碱基20-36之间(Sl)。
如序列排序中所示分析的的大部分突变体包含由宿主细胞出人意料地产生的符 合读框的缺失。
通过用从LI和SI突变的克隆制备的DNA转化大肠杆菌BL21 (DE3)细胞进行突变 体的筛选通过在包含100 ii g/ml氨苄青霉素、50iig/ml甲基绿、lmg/mlPDP (酚酞二磷酸） 的LB平板上划线，筛选高PhoC活性的单转化体茬该培养基上产生PhoC的细胞变成绿色 (10)。
用pNPP作为PhoC活性的底物在液体培养基中对这些突变体产生的PhoC进行的 定量分析。测定在液体培养基中生长0、30、90、180分钟的实变体的细胞提取物和上清液的 比活性为：
实施例21-Maf-相关蛋白质的C_端缺失
MC58的730蛋白质具有如下序列：
730显示与0RF46类似的特性（见以上實施例8):
-与0rf46 —样730序列在MenB、 MenA和淋球菌之间的保守性仅对N-未端部分高（>80%)。 C-未端（自?340)是高度趋异的
-其预计的二级结构包含跨越分子中心区域（aa. 227-247)的疏水片段。
-大肠杆菌中全长基因的表达产生产量很低的蛋白质从标记的或未标记的构建
物（除去信号肽序列）的表达对宿主细胞有蝳性影响。换言之细胞质中全长成熟蛋白质的
存在对宿主细胞是非常毒的，而当其转位至周质（由信号肽介导）对细胞生存力没有可检
測的影响730的这种"细胞内毒性"特别高，因为只可用recA遗传背景（大肠杆菌菌株：
用于克隆的HB101 ;用于表达的HMS174(DE3))以很低的频率得到用于表达无前导肽嘚730
为了克服这种毒性将实施例8中用于0RF46的类似方法用于730。得到四种C-未端截短的形式每种都被很好地表达。它们都是从His-标记的无前导肽730的細胞内表达得到的
形式A由成熟蛋白质的N-未端疏水区域（aa. 28_226)构成。将其纯化性作为可溶性His标记的产物其具有比预计更高的分子量（丽）。
形式B延伸至血清群之间保守的区域（aa. 28-340)的未端将其纯化为不溶性His标记的产物。
在筛选能在菌株HMS174(DE3)中高水平表达730_His克隆的克隆后获得命名为Cl和C2嘚C-未端截短的形式。简言之用含有编码全长成熟730蛋白质的His标记的序列的pET21b质粒转化recA菌株HMS174(DE3)。低频率得到转化体其显示出两种表型：大集落囷非常小的集落。分析了若干大集落和小集落对730-His克隆的表达只有大集落的细胞超量表达抗730A抗体识别的蛋白质。但是不同集落中超量表達的蛋白质的分子量各不相同。对其中的两个克隆进行测序表明：这两种情况中在编码730的C未端区域的序列中发生了大肠杆菌IS序列的整合。这两个整合在C1中产生了与另一个密码子的符合读框的融合在C2中产生了与另外12个密码子的符合读框的融合（11)。产生的730
由插入产生的其它氨基酸下加下划线
由插入产生的其它氨基酸下加下划线。
总之730-Cl形式的细胞内表达产生大很高水平的量蛋白质，且对宿主细胞无毒而忝然C-未端的存在则是有毒的。这些数据表明730的"细胞内毒性"与蛋白质的C-未端65氨基酸相关
用有或无前导肽（氨基酸1-26 ;缺失得到胞质表达）和有戓无His-标记的表达，已进行了 0RF29到前231或368氨基酸的相等的截短 实施例22-961中的结构域
如上实施例9所述，在大肠杆菌中最佳地表达961的GSt融合为了改进表达，将蛋白质分成结构域（12)
以YadA(由耶尔森氏菌产生的粘附素，已证明其是位于细胞表面上的粘附素其形成产生表面凸起的低聚物)为基礎，设计了 916的结构域它们为：前导肽、头部结构域、巻曲-螺旋区域（茎部）和膜锚着点结构域。 有或无前导肽表达这些结构域且任选哋融合于C-未端His-标记或N-未端GST。用SDS-PAGE和Western印迹从过夜（o/n)培育或用IPTG诱导3小时后，分析表达961不同结构域的大肠杆菌克隆用于表达的蛋白质的产生和定位结果如下：
这些结果在大肠杆菌中显示： ? 961-L是高度表达的且位于外膜上。用Western印迹分析已检测到2个特异性条带：一条为?45kDa(预计的分子量）另一条为?180kDa，表明961-L可以形成低聚物另外，这些聚集体在过夜培养物（无IPTG诱导）中表达得更多用该克隆的OMV制备物免疫接种小鼠，并獲得血清用过夜培养物（主要为寡聚物形式）的血清是杀菌的；IPTG-诱导的培养物（主要为单体）不是杀菌的。
*961 Al-L(在锚区域中部分缺失）是高喥表达的且位于外膜，但不形成低聚物； '961c-L(无锚区域）以可溶的形式产生并被在上清液中输出。 使用His-融合的ELISA和血清杀菌试验中的滴定度洳下：
961是否是粘附素（参见YadA)用（a)人上皮细胞和（b)大肠杆菌克隆（过夜培育或IPTG诱导3小时后），进行粘附试验过夜培育的961-L(961 ArL)和IPTG诱导的961c_L(在表面仩表达蛋白质的克隆）粘附于人上皮细胞。
也将961c用于杂交蛋白（见上）由于961和其结构域变体指导高效表达，它们理想地适用于杂交蛋白嘚N-未端部分 实施例23-其它杂交体
以下显示了本发明的其它杂交蛋白（同样参见14)。当与单独蛋白质相比时它
可以理解本发明仅以例子的方式进行描述，在本发明的范围和精神内还可进行改
变例如，设想可以使用其它菌株的蛋白质
下表总结了所用的FPLC蛋白质纯化：
NaCl、5. 0mg/ml CHAPS和10% v/v甘油。将透析液以13000g 离心20分钟加样到单Q或单S FPLC离子交换树脂上。按照感兴趣蛋白质的pI和FPLC 方法手册 选择缓冲液和离子交换树脂用分步NaCl梯度法脱蛋皛质。用SDS-PAGE分析纯化并用 Bradford方法测定蛋白质浓度。
'方法'栏中的字母为以下含义：
8以终浓度1. 0mM的IPTG诱导重组蛋白质 的表达。培育3小时后于4t:以8000离惢15分钟收获细菌。必要时将细胞存储于-2(TC 随后的所有步骤都是在冰上或4t:进行的。对胞质蛋白质（121. 1、128. 1、593、726和982)和 周质蛋白质920L而言将细菌重悬浮于25ml含完整蛋白酶抑制剂（Boehringer-Mannheim) 的PBS中。用Branson Sonifier 450通过超声处理裂解细胞以8000g离心破碎的细胞 30分钟，以沉淀未破碎的细胞和包含体并加入3. 9M(NH4) 2504使上清液达箌35% v/v饱和。 以8000g沉积沉淀物30分钟添加3. 9M(NH4)2S04使上清液达到70% v/v饱和，如上所述 收集沉淀物用SDS-PAGE鉴定含感兴趣蛋白质的沉淀物，并用适合的离子交换缓冲液（见 以下）透析6小时或过夜按Evans等的方法制备 表达953L大肠杆菌的周质组分，并用适合的离子交换缓冲液透析根据感兴趣蛋白的pi 和FPLC方法手冊的推荐选择缓冲液和离子交换树脂。缓冲液包括20mM NaCl和10% (v/v)甘油以13000g离心透析液20分钟，并加到单Q或单S FPLC离子交换树 脂上根据感兴趣蛋白的pI和FPLC方法掱册的推荐选择缓冲液和离子交换 树脂。用分步或连续NaCl梯度从离子交换树脂洗脱蛋白质用SDS-PAGE分析纯化，并用 Bradford方法测定蛋白质浓度通过NH2-未端测序（见以下）验证周质蛋白质的前导肽 的切割。
因为重组蛋白质在37。C的表达导致细胞的 裂解以终浓度为1. 0mM的IPTG诱导重组蛋白质的表达。培育3小时后于4°C以8000g 离心15分钟收获细菌。必要时将细胞存储于-2(TC。随后的所有步骤都是在冰上或4t: 进行的将细菌重悬浮于25ml含完整蛋白酶抑制剂（Boehringer-Mannheim)的PBS中，并 通过French 5ml 20mM Tris-HCl (pH 8. 0)、1.0M NaC1、5. Omg/ml CHAPS、腦(v/v)甘油和完整的蛋白酶抑制剂中将此溶液混 合过夜，以100000g离心45分钟用适当选择的缓冲液透析上清液6小时。對0rf25. L而 言发现在CHAPS提取后得到的沉淀物包含重组蛋白质。无需进一步纯化可将该组分用于 免疫接种小鼠。
FPLC-C :与FPLC-A相同但从用多粘菌素B渗透大腸杆菌后得到的可溶性组分进 行纯化，而不是在细胞破碎后进行的
蛋白质。用SDS-PAGE分析纯化并用Bradford方法测定蛋白质浓度。 克隆策略和寡核苷酸设计
用以脑膜炎奈瑟球菌B MC58的基因组序列为基础设计的寡核苷酸通过PCR扩增 编码感兴趣抗原的基因。除非特别指出通常将菌株2996的基因组DNA鼡作PCR反应的模 板，将扩增的片段克隆入表达载体pET21b+(Novagen)从而以C-未端His标记的产物形式 表达该蛋白质，或将其克隆入pET-24b 当蛋白质不用融合配体和用其洎身前导肽（如果存在时）表达时进行开放读框 (ATG到终止密码子）的扩增。
当蛋白质以'未标记的'的形式表达时通过从预计的前导序列设計5'-端扩增 引物下游除去前导肽。
用于PCR的引物的解链温度取决于整个引物中杂交核苷酸的数量和类型并用以 下公式确定：
对整个寡聚物而訁，所选寡核苷酸的解链温度通常为65-7(TC仅针对杂交区域， 解链温度为50-60°C
NH40H中，在56t:培育5小时以去保护加入0. 3M乙酸钠和2体积的乙醇沉淀寡聚物。将
用适合的限制酶消化相应于扩增片段的纯化DNA从而克隆入pET-21b+、 pET22b+、或pET-24b+。用QIAquick PCR纯化试剂盒（按制造商的说明）纯化消化的片段 用1120或10mM Tris(pH 8. 5)洗脱。用適合的限制酶消化质粒载体加到1. 0%琼脂糖凝胶 上，用Qiagen AIQquick凝胶提取试剂盒纯化相应于消化的载体的条带 克隆
将预先消化和纯化的、相应于各基因的片段连接到pET21b+、pET22b+或pET_24b+ 中。将在连接缓冲液（由制造商提供）中的T4DNA连接酶用于摩尔比为3 : l的片段/载 体
通过在冰上培育连接酶反应溶液和细菌40分钟，然后在37t:培育3分钟将重组 质粒转化入感受态大肠杆菌DH5或HB101中。
然后添加800 ii 1 LB肉汤并在37。C培育20分钟在E卯endorf微型离心机中 以最高速度离心這些细胞，并重悬浮于约200 ii 1的上清液中并涂布在到LB氨苄青霉素 (100mg/ml)琼脂上。
在4. Oml LB肉汤+100 y g/ml氨苄青霉素中培育随机选择的集落过夜进行重组 集落的筛選。使细胞沉淀并按制造商的说明用Qiagen QIApr印SpinMinipr印试剂盒提 取质粒DNA。用适合的限制酶消化约1 P g的各微型制备物将消化物加到1-1. 5%琼脂糖 凝胶（取决于預计的插入大小）与分子量标记（lkbDNA Ladder,GIBCO)平行。根据插入的 大小选择阳性克隆 表达
各基因克隆入表达载体后，将重组质粒转化入适合表达重组疍白的大肠杆菌菌 株中如上所述，用liU各构建物转化大肠杆菌BL21-DE3将单重组集落接种入2ml LB+Amp(100ii g/ml)中，在37C培育过夜，然后在100ml烧瓶中用20ml LB+Amp (100 y g/ml) 以1 : 30稀释使0D6。茬0. 1-0. 2之间。将烧瓶置于旋转式水浴摇床中于3(TC或37C培 育，直到0D600显示适合诱导表达的指数生长期（0. 4-0. 80D)加入1. OmM IPTG诱导蛋白 质表达。在3(TC或37t:培育3小时后测萣0D6。并检测表达。用微型离心机离心1. Oml各 样品将沉淀物重悬浮于PBS中，用SDS-PAGE和考马斯蓝染色分析 Gateway克隆和表达
是根据介节噬菌体整合入大肠杆菌基因组和从大肠杆菌基因组切除噬菌体的重组反应。整 合包括在位于细菌基因组attB位点中的噬菌体DNA的attP位点的重组（BP反应）和产生 侧翼于attL囷attR位点的整合的噬菌体基因组切除将attL和attR位点重组回attP 和attB位点（LR反应）。整合反应需要两种酶 (BP克隆酶）切除反应需要Int、IHF和其它噬菌体酶切除酶（Xis) (LR 克隆酶）。将25-bp细菌attB重组位点的人工衍生物（涉及Bl和B2)加到用于PCR反应 的引物的5'端以扩增奈瑟球菌的ORF。用BP克隆酶将得到的产物BP克隆入包含噬菌 体attP重组位点的互补衍生物的"供体载体"中。得到的"进入克隆"包含侧翼于attL位 点的衍生物（Ll和L2)的ORF用LR克隆酶将其亚克隆入包含attL-相容的attR位點的衍生物的表达"目的载体"中。得到"表达克隆"其中0RF侧翼于B1和B2，且在读框内融合 于GST或His N未端标记
用于GATEWAY表达的大肠杆菌菌株是BL21-SI。通过在含有鹽（0. 3MNaCl)的培养 基中培育诱导该菌株的细胞表达T7RNA聚合酶。 要注意的是该系统产生N-未端His标记 膜蛋白的制备
分离主要由内膜、外膜或全膜构成嘚组分，以获得由膜定位的前导序列表达的 重组蛋白制备膜组分（富含重组蛋白）的方法是采用Filip等和Davies等人的方法。于37C，在20ml LB/Amp(100y g/ml)液体培养基Φ使携带感兴趣质粒中的单集落生长过夜用1. OL新鲜培 养基以l :
v/v甘油中。OrflL和0rf40L都定位于且在外膜组 分中富含将其用于免疫接种小鼠。用标准Bradford试驗（Bio-Rad)计算蛋白质浓度用 DC蛋白质试验（Bio-Rad)确定内膜组分的蛋白质浓度。用SDS-PAGE分析分离步骤中的各 种组分
His-标记的蛋白质的纯化
从菌株2996和MC58中克隆叻 287的各种形式。用C-未端His标记的融合体 进行构建其包括成熟形式（aal8-427)、含缺失（Al、 A 2、 A3和A 4)的构建物和由B 或C结构域组成的克隆。对以His-融合体纯化嘚各克隆而言划线接种单集落，并且在 37°C LB/Amp(100iig/ml)琼脂板上培育过夜将从该平板上分离的集落接种到20ml LB/ Tris-HCl、 pH 7. 5)，并用Dounce匀浆器处理10次以13000g离心匀浆30分钟並保留上清液。将 可溶的和不溶制备物的上清液与150iU附2+-树脂（预先用缓冲液A或缓冲液B平衡） 混合并在室温温和振荡培育30分钟。树脂是按制慥商说明制备的Chelating S印harose Fast Flow(Pha潔ia)于4°C ，以700g离心分批制备物5分钟弃去上清液。用10ml缓冲 液A或B洗涤树脂2次（分批）10分钟重悬浮于1. Oml缓冲液A或B中，加到一佽性柱上 用（i)缓冲液A(4t:)或（ii)缓冲液B(室温）持续洗涤树脂，直到流出物的0D280达到 0.02-0.01再用（i)冷缓冲液C(300mM NaCl、50mM磷酸盐缓冲液、20mM咪唑、pH 8.0)或 4.5和任选地8M尿素）洗脱His-融合蛋白，收集组分直到OD显示获得 了所有重组蛋白。用SDS-PAGE分析20iU量的各洗脱组分用Bradford试验计算蛋白质 浓度。
变性的His-融合蛋白的复性
需要變性以稳定287bMC8因此在免疫接种前需要进行复性步骤。将甘油加到上 述得到的变性组分中使终浓度为10% v/v。用透析缓冲液1(10% v/v甘油0.5M精氨酸、 50mM磷酸鹽缓冲液、5. OmM还原的谷胱甘肽、0. 5mM氧化的谷胱甘肽、2. OM尿素，pH 8.8) 将蛋白质稀释至200yg/ml用相同的缓冲液在4t:透析12-14小时。于4C，用缓冲液
根据制造商的推荐用配备在线乙内酰苯硫脲-氨基酸分析仪（System Gold)的 Beckman测序仪（LF 3000)进行蛋白质NH2-末端的自动测序分析。 免疫接种
在第0、21和35天用抗原免疫接种Balb/C小鼠，在苐49天分析血清 血清分析-ELISA
将不包囊的MenB M7和包囊的菌株置于巧克力琼脂板上，在37 °C 、5 % C02中 培育过夜用无菌Dracon刷从琼脂板上收集细菌菌落，并接种箌含有0. 25 %葡萄糖的 Mueller-Hinton肉汤（Difco)中每30分钟监测一次细菌的生长，随后测定0D62。让细菌 生长直到OD达到0. 4-0. 5将培养物以4000rpm离心10分钟。弃去上清液用PBS洗涤細 菌2次，重悬浮于含有0. 025%甲醛的PBS中并在37t:培育1小时，然后在4C搅拌培育过 夜。在96孔Greiner板的各孔中添加100 y 1细菌细胞并在4"C培育过夜。然后用PBT洗 涤缓沖液（0. 1 % Tween-20的PBS溶液）冲洗这些孔3次在各孔中加入200 y 1饱和缓冲 液（2.7%聚乙烯吡咯烷酮10的水溶液），将这些平板在37t:培育2小时用PBT冲洗这些 孔3次。在各孔中加入200iil稀释的血清（稀释缓冲液：1% BSA、0. 1% Tween-20、0. 1%NaN3的PBS溶液）将这些平板在37t:培育2小时。用PBT冲洗这些孔3次在各孔中加 入100 ill HRP-缀合的兔抗-小鼠（Dako)血清（用稀释缓冲液以1 : ELISA滴定度，即高于预先免疫血清稀释度的、0D490值为0. 4的血清稀释度当0D490值 为0. 4的血清稀释度高于1 : 400时，将ELISA视为阳性 血清分析-FACS扫描细菌結合分析
将不包囊的MenB M7菌株置于巧克力琼脂板上，在37°C 、5% C02中培育过夜用无 菌Dracon刷从琼脂板上收集菌落，并接种到4支装有0.25X葡萄糖的8ml Mueller-Hinton 肉汤（Difco)试管Φ每30分钟监测细菌的生长，然后测定0062。让细菌生长直到OD达 到0. 35-0. 5将培养物以4000rpm离心10分钟。弃去上清液用封阻缓冲液（1% BSA的 PBS溶液，O. 4% NaN3)重悬浮沉澱物并以4000rpm离心5分钟。将细胞重悬浮于封阻缓 冲液使OD62。达到0. 05在96孔Costar板的各孔中添加100 y 1细菌细胞。在各孔中加
在4t:培育2小时以4000rpm离心细胞5分钟，吸出上清液在各孔中加入200 y 1/孔封 阻缓冲液洗涤细胞。在各孔中加入lOOiU R-Phicoerytrin缀合的F(ab)2山羊抗-小鼠 (以l : 100稀释）将平板置于4t:培育1小时。以4000rpm离心5分钟以沉澱细胞加 入200iil/孔封阻缓冲液洗涤细胞。吸出上清液细胞重悬浮于200iil/孔PBS、0.
CaCl2和0. 5% (w/v)BSA(分析缓冲液））以105CFU/ ml工作稀释度稀释细菌。最终反应混合物的总体積为50iU其中25 iU连续2倍稀释的 测试血清，12. 5 iil工作稀释度的细菌12. 5 iil幼兔补体（终浓度25% )。 对照包括：用补体血清培育的细菌、用细菌培育并在56t:加热30分鍾补充灭活的 免疫血清在加入幼兔补体后，用斜置方法立即将10 iU对照置于Mueller-Hinton琼脂板 上（0时间）37。C旋转培育96孔板1小时将每份样品的7 ii 1涂布在Mueller-Hinton瓊 脂板上作为斑点，而用斜置方法将10 ii 1对照涂布在Mueller-Hinton琼脂板上（1时间） 37t:培育琼脂板18小时，计算相应于0时间和1时间的菌落数量 血清分析-Western印迹法
将纯化的蛋白质（500ng/泳道）、外膜小泡（5 y g)和MenB菌株2996衍生的全细 胞提取物（25iig)加到12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，并转移到硝基纤维素膜上用转化 缓冲液（0.3% Tris碱，l. 14%甘氨酸、20% (v/v)甲醇）在4°C 、 150mA进行转化2小时 于4t:在饱和缓冲液（10%脱脂乳、0. 1% Triton X100的PBS溶液）中培育过夜使膜饱和。用冲洗缓冲液（3%脱脂乳、0. 1% Triton X100的PBS溶液）冲洗膜2次并在37。C与用洗 涤缓冲液以l : 200稀释的小鼠血清一起培育2小时冲洗膜2次，与1 : 2000稀释的辣 根过氧化物酶标记的抗_小鼠Ig —起培育90分钟鼡0. 1% Triton X100的PBS溶液冲 钟，在冰上超声处理破碎细胞5分钟（50%负载循环（dutycycle)、50X输出Branson超声 仪3mm微型针头）。以5000g离心10分钟除去未破碎的细胞回收含有完整细胞包膜组分 的上清液，于4t:以50000g进一步离心过夜将含有膜的沉淀物重悬浮于2%二烷基肌氨 酸、20mM Tris-HCl pH7. 5、2mM EDTA中，在室温培育20分钟以溶解内膜以10000g离心 上清液10分钟除去聚集体，以50000g进一步离心上清液3小时用PBS冲洗含有外膜的 沉积物，并重悬浮于相同的缓冲液中用BSA作为标准，由D.C.Bio-Rad蛋白分析（改进嘚 Lowry方法）测定蛋白质的浓度
如下制备全细胞提取物：使脑膜炎奈瑟球菌在GC板上培育过夜，用接种环收获 并重悬浮于lml 20mM Tris-HCl中。在56C热灭活30分鍾。 961结构域的研究
细胞组分的制备用过夜培养物或在IPTG培育3小时后的细菌制备表达961不同 结构域的大肠杆菌克隆的全裂解物、周质、上清液和OMV简单地说，获得周质细菌悬浮于 蔗糖25X和Tris 50mM(pH 8)(含有polimixine 100 ii g/ml) 。 1小时后室温以13000rpm 离心细菌15分钟，收集上清液用0. 2 ii m过滤培养物上清液，在冰中用TCA 50%沉淀2小 时离心（13000rp，30分钟）后用乙醇70X漂洗沉淀物2次，并悬浮于PBS中如上所 述，进行OMV制备用针对GST-961的多克隆抗血清，在SDS-PAGE或Western印迹中分析 各细胞组分
粘附分析在补充有10X热灭活的PCS、15mM L-谷氨酰胺和抗生素的DMEM(Gibco) 中维持张氏（Chang)上皮细胞（Wong-Kilbourne衍生物，克隆1-5c-4人结膜）。 为了进行粘附分析用PBS漂洗张氏上皮细胞的亚融合培养物，并用胰蛋白 酶-EDTA(Giboc)处理从而从塑性支持体上释放它们。然后将细胞悬浮于PBS中计数并
