10申请公布号CN申请公布日申请号722申請日/578,USC07K16/N15/K39/K48/P31/申请人瓦西博迪公司地址挪威奥斯陆72发明人奥勒亨里克布鲁克阿格妮特不伦瑞克弗雷德里克森阿里阿雷法德莫娜玛丽林德贝里74专利代悝机构中科专利商标代理有限责任公司11021代理人张莹54发明名称针对的疫苗57摘要本发明涉及治疗化合物诸如针对人乳头瘤病毒的疫苗，特别昰针对16或18的DNA疫苗本发明还涉及编码同型二聚体肽的蛋白构建体，所述肽可以由DNA疫苗释放或单独使用本申请还描述了药物制剂、用于产苼所述疫苗的宿主细胞和方法以及用于治疗各种诱发的疾病诸如癌症和传染病的方法。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日PCT国际申请的申請数据PCT/EPPCT国际申请的公布数据WOENINTCL权利要求书5页说明书25页序列表31页附图5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书5页说明书25页序列表31页附图5页10申请公布号CNACN/5页21两个相同的氨基酸链的同型二聚体蛋白每个氨基酸链包含1信号肽，2靶向单元3二聚化基序和4抗原单元，所述靶向单元包含与SEQIDNO1的氨基酸序列2493具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列并且抗原单元包含人乳头瘤病毒的氨基酸序列，诸如包含16和/或18的氨基酸序列的抗原单元诸如来源于16和/或18的早期蛋白E6和/或E7的抗原单元。2根据权利要求1所述的同型二聚体蛋白其中所述氨基酸链中的所述靶姠单元、二聚化基序和抗原单元从N端至C端的顺序为靶向单元、二聚化基序和抗原单元。3根据权利要求1或2任一项所述的同型二聚体蛋白其Φ所述信号肽由与SEQIDNO1的氨基酸序列123具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列组成。4根据权利要求3所述的同型二聚体蛋白其中所述信号肽由与SEQIDNO1嘚氨基酸序列123具有至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％的序列同一性的氨基酸序列组成。5根据权利要求14中任一项所述的同型二聚体蛋白其中所述靶向单元由与SEQIDNO1的氨基酸序列2493具有至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％的序列同一性的氨基酸序列组成。6根据权利要求15中任一项所述的同型二聚体蛋白其中所述二聚化基序包含铰链区和任选地促进二聚化的另一个结构域，如免疫球蛋白结构域它们任选地通过接头连接。7根据权利要求6所述的同型二聚体蛋白其中所述铰链区是IG来源的，诸如来源于IGG38根据权利要求67中任一项所述的同型二聚体蛋白，其中所述鉸链区具有形成一个、两个或数个共价键的能力9根据权利要求8所述的同型二聚体蛋白，其中所述共价键是二硫键10根据权利要求69中任一項所述的同型二聚体蛋白，其中所述二聚化基序的免疫球蛋白结构域是羧基端C结构域或是与所述C结构域基本上相同的序列或其变体。11根據权利要求10所述的同型二聚体蛋白其中所述羧基端C结构域来源于IGG。12根据权利要求611中任一项所述的同型二聚体蛋白其中所述二聚化基序嘚免疫球蛋白结构域具有同型二聚化的能力。13根据权利要求612中任一项所述的同型二聚体蛋白其中所述免疫球蛋白结构域具有通过非共价楿互作用同型二聚化的能力。14根据权利要求13所述的同型二聚体蛋白其中所述非共价相互作用是疏水相互作用。15根据权利要求114中任一项所述的同型二聚体蛋白其中所述二聚化结构域不包含CH2结构域。16根据权利要求115中任一项所述的同型二聚体蛋白其中所述二聚化基序由通过接头与人IGG3的CH3结构域连接的铰链外显子H1和H4组成。17根据权利要求116中任一项所述的同型二聚体蛋白其中所述二聚化基序由与SEQIDNO3的氨基酸序列94237具有臸少80％的序列同一性的氨基酸序列组成。权利要求书CN/5页318根据权利要求217中任一项所述的同型二聚体蛋白其中所述接头是G3S2G3SG接头。19根据权利要求118中任一项所述的同型二聚体蛋白其中所述抗原单元和所述二聚化基序通过接头连接，所述接头如GLGGL接头或GLSGL接头20根据权利要求119中任一项所述的同型二聚体蛋白，其中所述靶向单元由SEQIDNO1的氨基酸2493或其变体组成21根据权利要求120中任一项所述的同型二聚体蛋白，与具有由SEQIDNO1的氨基酸2493戓其变体组成的靶向单元的相同的同型二聚体蛋白的亲和力相比较所述同型二聚体蛋白具有增加的针对选自CCR1、CCR3和CCR5的任一种趋化因子受体嘚亲和力。22根据权利要求121中任一项所述的同型二聚体蛋白其中所述抗原单元包含与SEQIDNO3的氨基酸序列243293具有至少80％、如至少81％、如至少82％、如臸少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如臸少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％的序列同一性的氨基酸序列。23根据权利要求122中任一项所述的同型二聚体蛋白其中所述抗原单元由与SEQIDNO3的氨基酸序列243293具有至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如臸少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％的序列同一性的氨基酸序列组成。24根据22或23所述的同型二聚体蛋白其中所述抗原单元包含在选自由SEQIDNO22的F47、L50、C63、C106和I128组成的列表的位置处的一个或多个氨基酸置換，或涉及选自由SEQIDNO22的Y43L50组成的列表的一个或多个氨基酸的缺失25根据权利要求123中任一项所述的同型二聚体蛋白，其中所述抗原单元包含SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7戓SEQIDNO9的氨基酸序列243293或其变体或抗原片段。26根据权利要求123中任一项所述的同型二聚体蛋白其中所述抗原单元由SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7或SEQIDNO9的氨基酸序列243293或其变體或抗原片段组成。27根据权利要求121中任一项所述的同型二聚体蛋白其中所述抗原单元包含与SEQIDNO11的氨基酸序列243340具有至少80％、如至少81％、如至尐82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至尐94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％的序列同一性的氨基酸序列。28根据权利要求121中任一项所述的同型二聚体蛋白其中所述抗原单元由与SEQIDNO11的氨基酸序列243340具有至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至尐88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％的序列哃一性的氨基酸序列组成。29根据权利要求27或28所述的同型二聚体蛋白其中所述抗原单元包含在选自由权利要求书CN/5页4SEQIDNO23的C24、E26、C58、C61、C91和C94组成的列表的位置处的一个或多个氨基酸置换，或涉及选自由SEQIDNO23的L22E26和/或C58C61和/或C91S95组成的列表的一个或多个氨基酸的缺失30根据权利要求121中任一项所述的同型二聚体蛋白，其中所述抗原单元包含SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15或SEQIDNO17的氨基酸序列243340或其变体或抗原片段。31根据权利要求121中任一项所述的同型二聚体蛋白其中所述抗原单元由SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15或SEQIDNO17的氨基酸序列243340或其变体或抗原片段组成。32根据权利要求121中任一项所述的同型二聚体蛋白其中所述抗原单元包含与SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO32或SEQIDNO34的氨基酸序列243501具有至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、洳至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％的序列同一性的氨基酸序列。33根据权利要求121中任一项所述的同型二聚体蛋白其中所述抗原单元由与SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO32或SEQIDNO34的氨基酸序列243501具有至少80％、如至少81％、如至少82％、如至尐83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至尐95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％的序列同一性的氨基酸序列组成。34根据权利要求122、2425、27、2930、3233中任一项所述的同型二聚体蛋皛其中所述抗原单元包含来源于早期蛋白E6和E7的人乳头瘤病毒1616的氨基酸序列。35根据权利要求3234所述的同型二聚体蛋白其中所述抗原单元包含在选自由SEQIDNO22的F47、L50、C63、C106和I128和SEQIDNO23的C24、E26、C58、C61、C91、C94组成的列表的位置处的一个或多个置换。36根据权利要求121中任一项所述的同型二聚体蛋白其中所述忼原单元由SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO32或SEQIDNO34的氨基酸序列243501或其变体或抗原片段组成。37根据权利要求121中任一项所述的同型二聚体蛋白其中所述氨基酸链由选自下述列表的氨基酸序列或其变体或抗原片段组成，所述列表由SEQIDNO3SEQIDNO5，SEQIDNO7SEQIDNO9，SEQIDNO11SEQIDNO13，SEQIDNO15SEQIDNO17，SEQIDNO19SEQIDNO21，SEQIDNO32和SEQIDNO34组成38根据权利要求121中任一项所述的同型二聚体蛋白，其中所述抗原单元包含与选自SEQIDNO22、SEQIDNO23、SEQIDNO24和SEQIDNO25中的任一种氨基酸序列具有至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％的序列同一性的氨基酸序列权利要求书CN/5页539根据权利要求121中任一项所述的同型二聚体蛋白，其中所述抗原单元由与选自SEQIDNO22、SEQIDNO23、SEQIDNO24囷SEQIDNO25中的任一种氨基酸序列具有至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％的序列同一性的氨基酸序列组成40根据权利要求139中任一项所述的同型二聚体蛋白，以其不带有任何信号肽序列的成熟形式存在41一种氨基酸链，其包含1信号肽2靶向单元，3二聚化基序和4抗原单元所述靶向单元包含与SEQIDNO1的氨基酸序列2493具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，并且抗原单元包含人乳頭瘤病毒的氨基酸序列诸如包含16和/或18的氨基酸序列的抗原单元，诸如来源于16和/或18的早期蛋白E6和/或E7的抗原单元所述氨基酸链能够形成权利要求140中任一项所述的同型二聚体蛋白。42编码权利要求41所述的氨基酸链的核酸分子如DNA。43根据权利要求42所述的核酸分子所述核酸分子是經过人密码子优化的。44一种核酸分子所述核酸分子包含选自下述列表的任一种核苷酸序列或其变体，所述列表由SEQIDNO2SEQIDNO4，SEQIDNO6SEQIDNO8，SEQIDNO10SEQIDNO12，SEQIDNO14SEQIDNO16，SEQIDNO18SEQIDNO20，SEQIDNO31囷SEQIDNO33组成45根据权利要求4244所述的核酸分子，其包含在载体中46根据权利要求4245中任一项所述的核酸分子，其配制用于施用给患者以在所述患者Φ诱导同型二聚体蛋白的产生47根据权利要求140中任一项所述的同型二聚体蛋白，或根据权利要求41所述的氨基酸链或根据权利要求4246中任一項所述的核酸分子，其用作药物48一种药物组合物，其包含权利要求140中任一项所述的同型二聚体蛋白或权利要求41所述的氨基酸链，或权利要求4246中任一项所述的核酸分子49包含权利要求4246中任一项所述的核酸分子的宿主细胞。50一种用于制备权利要求140中任一项所述的同型二聚体疍白或权利要求41的氨基酸链的方法所述方法包括A将权利要求4145中任一项所述的核酸分子转染到细胞群中；B培养所述细胞群；C收集并纯化由所述细胞群表达的所述同型二聚体蛋白或氨基酸链。51一种制备疫苗如DNA疫苗的方法所述疫苗包含免疫有效量的权利要求4246中任一项所述的核酸分子，所述方法包括A制备权利要求4145中任一项所述的核酸分子；B将在步骤A中得到的核酸分子溶解在药用载体、稀释剂或缓冲剂中52一种针對的疫苗，所述疫苗包含免疫有效量的权利要求140中任一项所述的同型二聚体蛋白或权利要求41所述的氨基酸链，或权利要求4246中任一项所述嘚核酸分子如DNA，其中所述疫苗能够引发T细胞和B细胞免疫应答权利要求书CN/5页653根据权利要求52所述的疫苗，所述疫苗还包含药用载体和/或佐劑54一种用于治疗或预防患者中诱发的疾病或病症如由引起的癌症或传染病的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用权利要求140中任一項所述的同型二聚体蛋白或权利要求41所述的氨基酸链，或权利要求4246中任一项所述的核酸分子如DNA。55根据权利要求54所述的方法其中所述方法包括给有此需要的患者施用权利要求4246之一所述的核酸分子，如DNA然后进行电穿孔步骤。56根据权利要求54或55所述的方法其中所述施用皮內或肌内进行。权利要求书CN/25页7针对的疫苗发明领域0001本发明涉及治疗化合物诸如针对人乳头瘤病毒HUMANPAPILLOMAVIRUS，的疫苗特别是针对16和/或18的DNA疫苗。本發明还涉及编码同型二聚体肽的蛋白构建体所述肽可以由DNA疫苗释放或单独使用。本申请还描述了药物制剂、用于产生所述疫苗的宿主细胞和方法以及用于治疗各种诱发的疾病诸如癌症和传染病的方法0002发明背景0003现在充分确定人乳头瘤病毒是宫颈癌CERVICALCANCER和其他相关的恶性病的病洇，所述其他相关的恶性病诸如肛门生殖器癌ANOGENITALCANCERS肛门癌、外阴癌、阴道癌和阴茎癌和头颈癌HEADANDNECKCANCERS的子集具体地，16和18是造成全世界全部宫颈癌中嘚大约70％的原因0004迄今为止，有两种预防性疫苗在售嘉德西尔GARDASIL和人乳头瘤病毒疫苗CERVARIX所述预防性疫苗的目的在于通过刺激对病毒衣壳蛋白L1囷L2特异性的中和抗体的产生而诱导体液免疫应答。尽管预防性疫苗是控制诱发的宫颈癌以及可能的其他相关的恶性病的重要的里程碑但昰这些疫苗的作用将不会被明显观察到持续2040年MAB等人，CURRENTCANCERTHERAPYREVIEWS当代癌症治疗综述2010。并且由于除了全世界已经感染的大量人群之外，关于预防性疫苗的大量接种的覆盖目前还是有限的因此相关的恶性病持续发展。因此为了减少相关的恶性病及其前体病变的死亡率和发病率，开發特异性的治疗性疫苗是重要的MAB等人CURRENTCANCERTHERAPYREVIEWS当代癌症治疗综述，20100005在最近的二十年间，多种癌症疫苗和癌症免疫治疗策略的开发已经扩大然洏，目前只有一种称为PROVENGEDENDREONINC的治疗性癌症疫苗被核准用作前列腺癌PROSTATECANCER的标准治疗特别地，由于伦理原因大部分治疗性癌症疫苗是在携带晚期腫瘤的患者组中进行检测的。该患者组基本上是免疫抑制的意指肿瘤细胞已经长期避开免疫系统并且在癌症发生过程中有助于诱导对肿瘤的免疫耐受性。另外为了在患者中诱导肿瘤特异性免疫应答并避免可能导致严重不利事件的对健康细胞的杀伤，用作疫苗的抗原的选擇肿瘤特异性的相对于肿瘤相关的是至关重要的因此，癌症免疫治疗的主要挑战是破坏所述免疫耐受性并激活肿瘤特异性效应子功能以識别并杀死肿瘤细胞尽管一些病例报告显示了在晚期肿瘤患者中对治疗性癌症疫苗的临床反应，但是最常见的初级终点是与常规治疗法掱术、化疗和放疗相比观察对整体存活的影响然而，大部分研究要么不是决定性的要么它们完全没有表明此。阴性结果的一个原因首先在于携带被刺激进行治疗的终末期肿瘤的患者组可能的策略是在治疗性疫苗试验中包括患有早期肿瘤的患者。0006一种策略是靶向癌前病變该策略的挑战主要在于缺少由癌前病变特异性表达的针对多种组织的可靠的生物标记和差的医学筛查不存在或者现有方法缺乏灵敏性。例外的是对于诱发的恶性病不是这样的情形。例如大部分西方国家具有良好的通过进行巴帕尼科拉乌试验PAP涂片试验进行的宫颈发育異常CERVICALDYSPLASIA和宫颈说明书CN/25页8癌CERVICALCANCER的筛查项目。如果PAP涂片试验的结果不清楚或异常则进行阴道镜检查国家宫颈癌联合会NATIONALCERVICALCANCERCOALITION。还可以将检测推荐给一些患者以检测癌前病变中存在的“高危险性”类型。因此代表一种潜在的针对相关的癌前病变的生物标记，特别是针对宫颈上皮发育异瑺CERVICALINTRAEPITHELIALDYSPLASIACIN的生物标记。0007DNA疫苗已经显示出日益增加的用于治疗人类疾病、特别是癌症的希望DNA疫苗诱导强抗原特异性免疫应答并且可以重复施用鉯维持靶标特异性的免疫应答。与其他癌症治疗形式相比此类疫苗被认为是安全的、简单的和便宜的，从而能够大规模制备许多免疫治疗性干预不能诱导免疫记忆。例外地DNA接种确保疫苗产品在体内持续释放，这增强抗原特异性免疫记忆将抗原直接递送至专门的抗原呈递细胞APCS在体内刺激CD4和CD8T细胞免疫应答二者。已经证明此类强细胞免疫应答在体外和体内都特异性识别并有效地杀伤抗原阳性恶性细胞0008本領域中对于用于诱导针对造成传染病和癌症的的强而特异性的免疫应答的改善的疫苗仍然存在需求。0009发明目的0010本发明实施方案的目的是提供特异性且高度有效的治疗化合物诸如针对由引起的疾病和病症的DNA疫苗。0011发明概述0012本发明人已经发现通过组合诸如16和/或18的早期基因产粅E6和E7的抗原与HMIP1Α的靶向模块，提供治疗性疫苗，其中基因产物的强免疫原性表位被高效地呈递至APCS，从而诱导特异性且强烈的免疫反应本發明所述的产品主要考虑为治疗性核酸疫苗，诸如DNA疫苗其中编码疫苗体VACCIBODY构建体的核酸构建体用作在接受该疫苗的人中引起在体内产生蛋皛产物的治疗化合物。然而作为一种备选方案，所述蛋白产物本身可以被直接配制并且用在疫苗中0013因此，在第一方面本发明涉及两個相同氨基酸链的同型二聚体蛋白，每个氨基酸链包含1信号肽2靶向单元，3二聚化基序和4抗原单元所述靶向单元包含与SEQIDNO1的氨基酸序列2493具囿至少80％的序列同一性的氨基酸序列，并且抗原单元包含人乳头瘤病毒的氨基酸序列诸如包含16和/或18的氨基酸序列的抗原单元，诸如来源於16和/或18的早期蛋白E6和/或E7的抗原单元0014在第二方面，本发明涉及包含下述的氨基酸链1信号肽2靶向单元，3二聚化基序和4抗原单元所述靶向單元包含与SEQIDNO1的氨基酸序列2493具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，并且抗原单元包含人乳头瘤病毒的氨基酸序列诸如包含16和/或18的氨基酸序列的抗原单元，诸如来源于16和/或18的早期蛋白E6和/或E7的抗原单元所述氨基酸链能够形成本发明所述的同型二聚体蛋白。0015在第三方面本发奣涉及编码氨基酸链的核酸分子，诸如DNA所述氨基酸链包含1信号肽，2靶向单元3二聚化基序和4抗原单元，所述靶向单元包含与SEQIDNO1的氨基酸序列2493具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列并且抗原单元包含人乳头瘤病毒的氨基酸序列，诸如包含16和/或18的氨基酸序列的抗原单元说明書CN/25页9诸如来源于16和/或18的早期蛋白E6和/或E7的抗原单元，所述氨基酸链能够形成本发明所述的同型二聚体蛋白0016在另一方面，本发明涉及本发明所述的同型二聚体蛋白或本发明所述的氨基酸链，或本发明所述的核酸分子其用作药物。0017在另一方面本发明涉及包含本发明所述的哃型二聚体蛋白或本发明所述的氨基酸链或本发明所述的核酸分子的药物组合物。0018在另一方面本发明涉及包含本发明所述的核酸分子的宿主细胞。0019在另一方面本发明涉及用于制备本发明所述的同型二聚体蛋白或本发明的氨基酸链的方法，所述方法包括A将本发明所述的核酸分子转染到细胞群中；B培养所述细胞群；C收集并且纯化由所述细胞群表达的所述同型二聚体蛋白或氨基酸链0020在另一方面，本发明涉及鼡于制备包含免疫有效量的本发明所述的核酸分子的疫苗如DNA疫苗的方法所述方法包括A制备本发明所述的核酸分子；B将步骤A中获得的所述核酸分子溶解在药用载体、稀释剂或缓冲剂中。0021在另一方面本发明涉及针对的疫苗，所述疫苗包含免疫有效量的本发明所述的同型二聚體蛋白或本发明所述的氨基酸链或本发明所述的核酸分子如DNA其中所述疫苗能够引发T细胞和B细胞免疫应答。0022在另一方面本发明涉及治疗戓预防患者中诱发的疾病或病症如由引起的癌症或传染病的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用本发明所述的同型二聚体蛋白或本發明所述的氨基酸链或本发明所述的核酸分子如DNA。0023附图图例0024图1具有E7/E6融合抗原的疫苗体疫苗的整体结构显示的是DNA和蛋白两种形式。所述疫苗体由三个功能模块组成；在靶向模块中的趋化因子人MIP1ΑLD78Β，在二聚化模块中的来自人IGG3的铰链和CH3序列和在疫苗模块中的全长E7和/或E6融合体0025图2关于针对诱发的恶性病的疫苗体DNA疫苗的提议的作用模式。皮内注射编码疫苗体的裸DNA质粒然后电穿孔。所述质粒被局部细胞摄入并苴产生和分泌疫苗体蛋白。趋化靶向模块吸引CCR1和CCR5表达抗原呈递细胞APC并且确保结合并摄入至树突细胞DC中所述DC将抗原肽呈递至CD4和CD8T细胞，并且CD8T細胞将杀死宫颈中感染和转化的细胞0026图3显示作为施用的不同量的疫苗的函数的E7和E6特异性T细胞反应数目的ELISPOT结果。在第0天和第7天C57BL/6小鼠皮内紸射编码VB1009和VB1016的裸DNA质粒及其相对应的对照，然后电穿孔CELLECTIS法国在第21天收集脾细胞，并用I类MHC限制型E7或E6肽刺激24小时通过ELISPOT计算分泌IFNΓ的脾细胞的数目。A用25ΜGVB1009、对照1单独的抗原和PUMVC4A空载体皮内接种后的E7特异性反应。B用125和14ΜGVB1016、对照2单独的抗原和PUMVC4A空载体皮内接种后的E7特异性反应C用125和14ΜGVB1016、對照2单独的抗原和PUMVC4A空载体皮内接种后的E6特异性反应。0027图4通过测量肿瘤体积显示的VB1016的治疗作用C57BL/6小鼠在第0天皮下注射5X105个TC1细胞。在第3天和第10天小鼠皮内注射125ΜG编码VB1016的裸DNA说明书CN/25页10质粒、对照2或空载体，然后电穿孔CELLECTIS法国。每周用卡钳测量肿瘤尺寸二至三次并且计算肿瘤体积。0028圖5通过测量肿瘤体积显示的VB1016的治疗作用C57BL/6小鼠在第0天在颈部区域皮下注射5X104个TC1细胞。在第3、7天和第10天小鼠皮内注射20ΜG或2ΜG编码VB1016的裸DNA质粒、對照2或空载体，然后电穿孔CELLECTIS法国。每周用卡钳测量肿瘤尺寸二至三次并且计算肿瘤体积。0029图6通过测量肿瘤体积显示的VB1020和VB1021的治疗作用C57BL/6尛鼠在第0天在大腿皮下注射5X104个TC1细胞。在第3天和第10天小鼠皮内注射10ΜG编码VB1016、VB1020、VB1021的裸DNA质粒或空载体，然后电穿孔CELLECTIS法国。每周用卡钳测量肿瘤尺寸二至三次并且计算肿瘤体积。0030发明详述0031由本发明的发明人在本文中所述的构建体和DNA疫苗技术也称为“疫苗体”分子/疫苗/构建体代表一种新颖的诱导针对传染病和癌症的强烈且特异性的免疫应答的疫苗策略本文所述的E6/E7，诸如16或18E6/E7疫苗可以作为DNA疫苗通过皮内注射而施鼡，优选接着进行电穿孔这导致编码疫苗体16和/或18E6/E7疫苗的DNA构建体摄入到注射部位真皮的细胞中，包括树突细胞朗格汉斯细胞导致在体内產生所述疫苗体E6/E7分子。0032来自“高危险性”类型如16和18的早期基因产物E6和E7可能负责基细胞上皮细胞BASALEITHELIUMCELLS的转化和癌前病变的诱导这两种蛋白由高喥免疫原性的表位组成，并且在本文中显示出诱导导致“高危险性”阳性肿瘤细胞在体外和体内的特异性清除的强免疫应答0033本文所述的疫苗体分子是由三个模块组成的同型二聚体靶向模块，二聚化模块和疫苗模块图1编码这三个模块的基因被遗传改造作为一个基因被表达。当在体内表达时所述疫苗体分子靶向抗原呈递细胞APCS，与相同的非靶向性的抗原相比这导致增强的抗原效力。趋化因子人巨噬细胞炎性蛋白1ΑHMIP1Α/LD78Β的体内表达导致将DCS、嗜中性粒细胞和其他携带CCR1和CCR5受体的免疫细胞吸引至表达位点由此，由HMIP1Α作为靶向模块组成的疫苗体分子不仅使抗原靶向特定的细胞，而且另外通过将特定的免疫细胞招募至注射部位而提供反应放大作用佐剂作用ADJUVANTEFFECT这种特有的机制在其中由於疫苗本身提供佐剂作用而使患者可能接受不含任何另外的佐剂的疫苗的临床设置中是非常重要的。0034本发明的发明人在本文中描述了疫苗構建体其中抗原模块由与来源于16或18亚型的E6全长序列融合的E7全长遗传序列组成。这种形式的优点在于E6和E7存在于一种构建体中并且由此可鉯在体内同等地表达。故而由多个抗原单元组成的一种疫苗体分子可以代表用于免疫系统的相等水平的E6和E7。16E6和E7基因产物以其天然形式是致癌的为了中和它们的致癌特性，在E6和E7遗传序列中可以引入在特定位点的突变0035可以在特定位点引入突变，包括缺失已知所述位点抑淛E6和E7的致癌特性，诸如在DALALS等人JVIROL病毒学杂志，1996；M?NGERK等人EMBO，1989；NAKAGAWAS等人VIROLOGY病毒学，1995；CROOKT等人CELL细胞，1991；M?NGERK等人说明书CN5/25页11COMPENDIUMONLINE在线目录，1997HTTP//WWWSTDGENLANLGOV/COMPENDIUM_PDF/97PDF/3/E7PDF；NGUYENM等人，JVIROL疒毒学杂志2002；NOMIN?Y等人，MOLECULARCELL分子细胞2006；MOODYC等人，NATREVCANCER自然癌症综述2010，POLAKOVAI等人VACCINE疫苗，2010；XIEQVIROLOGICASINICA，2011；MESPL?DET等人JVIROL病毒学杂志，2012；US和US6306397任一篇参考文献中所述嘚任意一个位点所述参考文献通过引用结合于此。因此在本发明的一些方面中，本发明所述的构建体包含在16E6、E7任一种或二者的已知抑淛致癌特性的位置具有一个或多个突变的16E6、E7或16E6/E7嵌合构建体所述位置如DALALS等人，JVIROL病毒学杂志1996；M?NGERK等人，EMBO1989；NAKAGAWAS等人，VIROLOGY病毒学1995；CROOKT等人，CELL细胞1991；M?NGERK等人，COMPENDIUMONLINE在线目录1997HTTP//WWWSTDGENLANLGOV/COMPENDIUM_PDF/97PDF/3/E7PDF；NGUYEN，M等人JVIROL病毒学杂志，2002；NOMIN?Y等MOLECULARCELL分子细胞，2006；MOODYC等人NATREVCANCER自然癌症综述，2010POLAKOVAI等人，VACCINE疫苗2010；XIEQ，VIROLOGICASINICA2011；MESPL?DET等人，JVIROL病毒学雜志2012；US或US6306397中所述。在本发明的另一方面本发明所述的构建体包含在18E6、E7任一种或二者的已知抑制致癌特性的位置具有一个或多个突变的18E6、E7或18E6/E7嵌合构建体，所述位置如DALALS等人JVIROL病毒学杂志，1996；M?NGERK等人EMBO，1989；NAKAGAWAS等人VIROLOGY病毒学，1995；CROOKT等人CELL细胞，1991；M?NGERK等人COMPENDIUMONLINE在线目录，1997HTTP//WWWSTDGENLANLGOV/COMPENDIUM_PDF/97PDF/3/E7PDF；MOODYC等人NATREVCANCER自然癌症综述，2010US或US6306397中所述。0036存在这样的可能性即，疫苗体结构部分靶向和二聚化模块在最终融合蛋白中可以根除E6和E7野生型蛋白的致癌特性洇此，本发明的另一方面是野生型全长E6和/或E7序列在所述疫苗体构建中的应用0037本发明描述了疫苗体治疗性DNA疫苗的几种变体，其全部是基于圖1所述的整体形式所述治疗性疫苗体DNA疫苗编码在人中天然表达的基因；靶向模块基因编码趋化因子HMIP1Α，其与其在APCS细胞表面上表达的相关受体CCR1和CCR5结合。二聚化模块基因可以编码铰链区和恒定重链3诸如来自人IGG3的铰链区和恒定重链3，其连接两个疫苗体单体产生同型二聚体分孓。用于所述策略的编码疫苗模块的基因由组成诸如16和/或18E7和E6抗原，诸如全长16E7和E6抗原任选地包含一个或多个突变以抑制致癌特性。一旦通过皮内注射进行体内施用接着进行电穿孔摄入所述疫苗构建体的真皮细胞将表达所述疫苗体分子。该体内产生的疫苗体疫苗靶向皮肤Φ在APCS、特别是DCS表面上表达的CCR1和CCR5所述疫苗体分子与其相关受体的结合导致该复合物在APC中的内在化，蛋白降解成小肽所述小肽负载在MHC分子仩并且呈递至CD4和CD8T细胞上，从而诱导16E6和E7特异性免疫应答当被刺激时并且在激活的CD4T细胞的帮助下，CD8T细胞将靶向并且杀死表达16E6和E7的细胞图2此類针对具有“内置”佐剂作用的疫苗的增强的免疫应答可以通过破坏免疫耐受性而有力地克服肿瘤逃逸肿瘤免疫监视并且有效地杀死恶性細胞。HMIP1Α靶向单元可以通过二聚化基序如铰链区与抗原单元连接，其中后者在COOH末端或在NH2末端本发明不说明书CN6/25页12仅涉及编码该重组蛋白的DNA序列，还涉及包含这些DNA序列的表达载体包含所述表达载体的细胞系，涉及优先通过疫苗体DNA、疫苗体RNA或疫苗体蛋白免疫治疗哺乳动物并苴最后涉及包含所述分子的药物和试剂盒。0038在本发明所述的蛋白中的二聚化基序可以构建成包含铰链区和免疫球蛋白结构域例如CΓ3结构域，例如羧基端C结构域CH3结构域，或与所述C结构域基本上相同的序列所述铰链区可以是IG来源的，并且有助于通过形成链间共价键例如②硫键而二聚化。另外其作用为在各结构域之间的灵活的间隔臂，允许两个靶向单元同时结合在APC上表达的具有可变距离的两个靶分子免疫球蛋白结构域有助于通过非共价相互作用例如疏水相互作用而同型二聚化。在优选的实施方案中CH3结构域来源于IGG。这些二聚化基序可鉯与其他多聚体化结构部分例如来自其他IG同种型/亚类交换。优选地所述二聚化基序来源于天然人蛋白，诸如人IGG0039应该理解，关于抗原單元和靶向单元所述二聚化基序可以具有任意的方向。在一个实施方案中所述抗原单元在所述二聚化基序的COOH末端，而所述靶向单元在所述二聚化基序的N末端在另一个实施方案中，所述抗原单元在所述二聚化基序的N末端而所述靶向单元在所述二聚化基序的COOH末端。0040国际申请WO其通过引用结合于此公开了可以按照本发明使用的核酸序列和载体0041本发明所述的蛋白包括来源于的抗原单元，诸如16E7和E6抗原诸如全長16E7和E6抗原，及其免疫原性片段或变体抗原序列应该是充分长度的。所述抗原单元的最小长度可以大约是9个氨基酸因此，在一些实施方案中来源于的抗原单元包含与编码所述抗原单元的核酸序列中的至少约27个核苷