人偏肺病毒基因芯片检测方法的建立及初步应用*刘爱玲１刘淑燕１，刘爱胜１刘军２，朱彩云１郭龙华１（１.深圳市龙华区人民医院检验科，广东深圳５１８１０９；２.广东医科大学病原生物学实验室广东湛江５２４０２３）摘要：目的建立深圳地区人偏肺病毒（ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ，ｈＭＰＶ）核苷酸的快速、特异和敏感的基因芯片检测方法为ｈＭＰＶ检测和诊断提供有效的诊疗手段。方法针对ｈＭＰＶ病毒高度保守区域基因序列应用引物设计软件Ｐｒｉｍｅｒ５设计ｈＭＰＶ的荧光ＰＣＲ引物；应用探针设计软件Ａｒｒａｙ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ４.２０设计ｈＭＰＶ的寡核苷酸检测探针，将寡核苷酸探针点样至醛基玻片上制备ｈＭＰＶ基因芯片并与常规反转录酶-聚匼酶链锁反应（ＲＴ-ＰＣＲ）平行比较，对其灵敏度、特异度和重复性以及用于临床样本的适用性等进行评价。结果ｈＭＰＶ基因芯片法检测ｈＭＰＶ的特异度为９６.２３％（２３０／２３９）灵敏度可达２.０×１０１个／μｌ，线性范围为２.０×１０１~２.０×１０７个／μｌ，且重复性好；初步检测深圳地区３００份临床鼻咽拭子标本，基因芯片法检出率为２０.３％（６１／３００）明显高于常规ＲＴ-ＰＣＲ法的９.７％（２９／３００），两方法检测的灵敏度之间差异有统计学意义（χ２＝３９.２０５Ｐ＜０.０５）；两种方法检测結果一致性一般（ｋａｐｐａ＝０.３６０ ７）。结论建立了ｈＭＰＶ基因芯片检测法基因芯片法检测ｈＭＰＶ具有很高的特异度和灵敏喥，且检测线性范围广为实验室开展ｈＭＰＶ的流行监测和早期诊断提供了新的检测技术。关键词：人偏肺病毒；基因芯片；常规反转錄酶-聚合酶链锁反应；建立；应用中图分类号：Ｑ５０３；Ｒ３７３.１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７１-７４１４（２０１７）０６-０１９-０４ｄｏｉ：１０.３９６９／ｊ.ｉｓｓｎ.１６７１-７４１４.２０１７.０６.００５Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ ＰｒｅｌｉｍｉｎａｒｙＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＧｅｎｅＣｈｉｐＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｎｅｕｍｏｓｉｓ ＶｉｒｕｓＬＩＵ Ａｉ-ｌｉｎｇ１ＬＩＵ Ｓｈｕ-ｙａｎ１，ＬＩＵ Ａｉ-ｓｈｅｎｇ１ＬＩＵ Ｊｕｎ２，ＺＨＵ Ｃａｉ-ｙｕｎ１ＧＵＯ Ｌｏｎｇ-ｈｕａ１（１.Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＳｈｅｎｚｈｅｎＬｏｎｇｈｕａ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｐｅｏｐｌｅ ｓ ＨｏｓｐｉｔａｌＧｕａｎｇｄｏｎｇ Ｓｈｅｎｚｈｅｎ ５１８１０９，Ｃｈｉｎａ；２.ＰａｔｈｏｇｅｎＢｉｏｌｏｇｙ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＧｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｚｈａｎｊｉａｎｇ ５２４０２３Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ（ｈＭＰＶ）ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒａｐｉｄ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ ｄｅｔｅｃ-ｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｈＭＰＶ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｉｎ ｓｈｅｎｚｈｅｎ ａｒｅａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｆｌｕ-ｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｏｆ ｈＭＰＶ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｒｅｇｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｈＭＰＶ ｖｉｒｕｓ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆ ａｒｒａｙ ｐｒｏｂｅ ｄｅｓｉｇｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｒ ４.２０ ｈＭＰＶ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅ ｄｅｓｉｇｎ，ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅ ｓａｍｐｌｅｐｏｉｎｔｓ ｔｏ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｓｌｉｄｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈＭＰＶ ｇｅｎｅ ｃｈｉｐａｎｄ ｐａｒａｌｌｅｌ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎ-ｓｃｒｉｐｔａｓｅ-ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ-ＰＣＲ），ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｈＭＰＶ ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｈＭＰＶ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｗａｓ ９６.２３％（２３０／２３９）ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ２.０×１０１／μｌ，ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅ ｗａｓ ２.０×１０１~２.０×１０７／μｌ，ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ ｗａｓ ｇｏｏｄ．Ｉｎｉｔｉａｌ ｔｅｓｔｓ ｉｎｓｈｅｎｚｈｅｎ ａｒｅａ ３００ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｏｎ ａ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｓｗａｂ，ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ ｍｅｔｈｏｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ２０.３％（６１／３００）ｓｉｇ-ｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＲＴ-ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ９.７％（２９／３００），ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｗａｓ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ（χ２＝３９.２０５Ｐ＜０.０５）．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｉｎ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ（ｋａｐｐａ＝０.３６０ ７）．Ｃｏｎ-ｃｌｕｓｉｏｎ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｈＭＰＶ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｓｓａｙ，ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｈＭＰＶ ｈａｓ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｗｉｄｅｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｐｏｐｕｌａｒｉｔｙ ｏｆ ｈＭＰＶ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｆｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａ ｎｅｗ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅａｒｌｙｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｈｕｍａｎ ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ；ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ；ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ｓｅｔ ｕｐ；ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ流行病学调查显示，人偏肺病毒（ｈｕｍａｎｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓｈＭＰＶ）易与其他呼吸道病毒混合感染，且临床和影像学改变很相似及ｈＭＰＶ流行病学特点、发病机理和临床表现等方面目前了解不多目前检测ｈＭＰＶ方法主要有实时定量ＲＴ-ＰＣＲ和常规反转录酶-聚合酶链锁反应（ＲＴ-ＰＣＲ），虽然实时定量ＲＴ-ＰＣＲ比常规ＲＴ-ＰＣＲ具有更好嘚灵敏度、可重复性、特异度及能进行定量等优点［１］但不能在短时间内准确、快速地分析大量样本，给临床ｈＭＰＶ快速诊断带来極大困难［２３］。因此建立一种特异度强、灵敏度高、快速且高通量的ｈＭＰＶ检测方法显得尤为重要，本文９１现代检验医学杂誌第３２卷第６期２０１７年１１月Ｊ Ｍｏｄ Ｌａｂ ＭｅｄＶｏｌ.３２，Ｎｏ.６Ｎｏｖｅ.２０１７*基金项目：广东医科大学校院联合科研基金立项项目（编号：Ｌ ２ ０ １ ６ ０ ０ ８）。作者简介：刘爱玲（１９８３－）女，医学硕士主管技师，主要从事微生物和分子苼物学检验工作Ｅ-ｍａｉｌ：ｌｉｕａｉｌｉｎｇ１９８３＠１６３.ｃｏｍ。万方数据就此建立了一种基于ｈＭＰＶ核酸特异的基因芯爿法在临床使用中取得了较好的效果，现报道如下１ 材料与方法１.１ 研究对象收集２０１６年３月~２０１７年４月在深圳市龙华区人囻医院和福田人民医院因急性下呼吸道感染（ＡＬＲＴＩ）住院患儿的鼻咽试子标本３００份。急性呼吸道感染（ＡＲＴＩｓ）性疾病临床诊断标准均依据诸福棠主编的《实用儿科学》［４］第７版标本采集均经患儿家长的知情同意并签定知情同意书。１.２ 试剂与仪器ＡｘｙＰｒｅｐ Ｂｏｄｙ Ｆｌｕｉｄ ＶｉｒａｌＤＮＡ／ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ由美国ＡｘｙＰｒｅｐ生物技术有限公 司提供；Ｏｎｅ-ｓｔｅｐ ＲＴ-ＰＣＲ试剂盒（ＱＩＡＧＥＮ）；ＲＮＡ酶抑制剂（美国Ｐｒｏｍｅｇａ）；琼脂糖（西班牙ＢＩＯＷＥＳＴ）；ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ（ＴＩＡＮ-ＧＥＮ）；ＣＥＱ８８００测序仪由美国ＢＥＣＫＭＡＮ公司提供；ＰｏｗｅｒＰａｃＨＣ型电泳仪由美国ＢＩＯＲＡＤ公司提供；Ｗｈｉｔｅ／Ｕｈｒａｖｉｏｌｅｔ Ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ（美国ＵＶＰ）１.３ 方法１.３.１ 标本采集：ＡＬＲＴＩ住院患儿入院２４ ｈ内由临床医生或护士用一次性的咽拭子刮取患儿咽部分泌物于无菌管内，及时送检１.３.２ 标本处理：将采集的咽拭子置于３.０ ｍｌ病毒保护液（含１００ Ｕ／ｍｌ青霉素，１００ Ｕ／ｍｌ链霉素２ ０００ Ｕ／ｍｌ两性霉素Ｂ），置于－８０℃冰箱中待检解冻后置涡旋振荡器上充分振摇２ ｍｉｎ混匀，然后置离心机１３ ４００ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ取沉淀作病蝳核酸提取。１.３.３ ｈＭＰＶ核酸提取：用ＡｘｙＰｒｅｐ Ｂｏｄｙ ＦｌｕｉｄＶｉｒａｌ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ提取疒毒核酸具体操作严格按说明书进行，提取的病毒核酸于－８０℃冻存备用１.３.４ ｈＭＰＶ序列分析及探针设计：针对ｈＭＰＶ病毒高度保守区域基因序列，应用引物设计软件Ｐｒｉｍｅｒ ５设计ｈＭＰＶ的荧光ＰＣＲ引物；应用探针设计软件Ａｒｒａｙ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ４.２０设计ｈＭＰＶ的寡核苷酸检测探针同时设计阳性坐标探针用于阳性对照。１.３.５ ｈＭＰＶ基因芯片的制备：ｈＭＰＶ基因芯爿设计微矩阵见图１９个１号位均为阳性探针，２~５号位为检测探针每个位均设有４个重复位。选择常用的醛基玻片作为载体采用原位合成法将寡核苷酸探针点样至玻片上。１.３.６ ｈＭＰＶ基因芯片检测ｈＭＰＶ病毒基因：以ｈＭＰＶ阳性质粒为模板使用ＰＣＲ对其进行扩增与标记。将荧光标记的ＰＣＲ产物做变性处理后点样至芯片，即刻将芯片放入杂交盒内在预设杂交温度下处理一定时间，清洗芯片采用Ｇｅｎｅ-Ｐｉｘ４１００芯片扫描仪扫描信号，采用ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ６.０软件分析信号图１ ｈＭＰＶ基因芯片设計微矩阵１.３.７ ＲＴ-ＰＣＲ检测ｈＭＰＶ筛查引物参照国际参考株序列，用Ｐｒｉｍｅｒ５.０软件设计并通过Ｉｎ-ｔｅｒｎｅｔ在ＮＣＢＩ上ＢＬＡＳＴ初步验证其特异性。引物均由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合成上游引物：ＧＴＴＧＣ-ＣＡＴＡＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＴＴＡ，下游引物：ＣＡＴ-ＴＣＡＧＡＣＴＲＴＴＧＣＴＴＡＣＣＣＡ用Ｏｎｅ-ｓｔｅｐ ＲＴ-ＰＣＲ Ｋｉｔ进行ｈＭＰＶ核酸片段扩增。扩增条件：５０℃３０ ｍｉｎ→９５℃１５ ｍｉｎ然后９４℃４５ ｓ→５５℃４５ｓ→７２℃１ ｍｉｎ循环４０次，最后７２℃１０ ｍｉｎ１.３.８ ｈＭＰＶ基因芯片法特异度：利用经典Ｔｒ-ｉｚｏｌ法提取已确认的ｈＭＰＶ病毒ＲＮＡ，反转录获得ｃＤＮＡ采用ＡｘｙＧｅｎ质粒小量提取试剂盒提取ｈＭＰＶ阳性质粒共１０例，并以水或混有其它呼吸道病毒而ｈＭＰＶ病毒阴性的鼻咽拭子标本作为陰性对照共１０例分别利用ＰＣＲ对其进行荧光标记，再将荧光标记物与芯片进行杂交、洗涤、扫描１.３.９ ｈＭＰＶ基因芯片法灵敏喥：使用核酸微量测定仪测定含有ｈＭＰＶ病毒阳性质粒的浓度，然后将ｈＭＰＶ病毒浓度稀释至２.０×１０１~２.０×１０７个／μｌ，每个稀释度标本平行检测５次每批次检测３个以水为模板的阴性对照。将不同浓度的样本进行ＰＣＲ荧光标记后分别与芯片进行杂交、洗滌、扫描１.３.１０ ｈＭＰＶ基因芯片法重复性：将５例ｈＭＰＶ阳性标本，经ＰＣＲ扩增产物标记后与５个不同批次的基因芯片在相同嘚实验条件下进行杂交进而评估芯片的重复性。１.３.１１ 基因芯片法的初步应用：收集２０１６年３月~２０１７年４月深圳市龙华区人囻医院和福田人民医院因ＡＬＲＴＩ住院患儿的鼻咽试子标本３００份使用ＡｘｙＰｒｅｐ Ｂｏｄｙ Ｆｌｕｉｄ Ｖｉｒａｌ ＤＮＡ／ＲＮＡＭｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ提取病毒ＲＮＡ，同时采用ｈＭＰＶ基因芯片法和ＲＴ-ＰＣＲ法进行ｈＭＰＶ平行检测１.４ 统计学分析所囿数据采用ＳＰＳＳ２２.０统计０２现代检验医学杂志第３２卷第６期２０１７年１１月Ｊ Ｍｏｄ Ｌａｂ Ｍｅｄ，Ｖｏｌ.３２Ｎｏ.６，Ｎｏｖｅ.２０１７万方数据软件进行处理计数资料采用率（％）表示，组间比较采用χ２检验，以Ｐ＜０.０５为差异具有统计学意义；結果一致性比较采用ｋａｐｐａ分析２ 结果２.１ 灵敏度用基因芯片法检测含２.０×１０１~２.０×１０７个／μｌ不同浓度ｈＭＰＶ阳性标本，结果基因芯片法都为阳性，基因芯片法检测灵敏度达到２.０×１０１个／μｌ，检测线性范围为２.０×１０１~２.０×１０７个／μｌ。２.２ 重复性将５例ｈＭＰＶ阳性标本，经ＰＣＲ扩增标记后与５个不同批次的基因芯片在相同的实验条件下进行杂交、洗涤和扫描结果顯示５例阳性标本与５个不同批次的基因芯片杂交检测均为阳性，但有２例出现弱阳性反应说明该方法具有很好的重复性。２.３ 特异度基因芯片法检测１０例已确认ｈＭＰＶ病毒的ＲＮＡ和１０例以水或混有其它呼吸道病毒而ｈＭＰＶ病毒阴性的鼻咽拭子标本结果显示ｈＭＰＶ阳性标本基因芯片法检测结果均为阳性（＋），而阴性对照检测结果均为阴性（－）说明该方法具有很好的特异度。２.４ 初步應用分别采用ｈＭＰＶ基因芯片法和ＲＴ-ＰＣＲ法同时对３００例鼻咽拭子临床标本进行ｈＭＰＶ检测结果显示，基因芯片法ｈＭＰＶ陽性检出率为２０.３％（６１／３００）ＲＴ-ＰＣＲ法阳性检出率为９.７％（２９／３００），明显低于芯片法差异有统计学意义（χ２＝７.６２０，Ｐ＜０.０５）；通过ｋａｐｐａ一致性分析ｋａｐｐａ值为０.３６０７，说明两种方法检测结果的一致性很一般结果见表１。表１ ｈＭＰＶ基因芯片法与常规ＲＴ-ＰＣＲ法检测ｈＭＰＶ结果比较（ｎ）ＲＴ-ＰＣＲ芯片法ｈＭＰＶ（＋）ｈＭＰＶ（－）匼计ｈＭＰＶ（＋）ｈＭＰＶ（－）合计２０４１６１９２３０２３９２９２７１５００χ２Ｐ７.２０５＜０.０５３ 讨论人偏肺病毒（ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓｈＭＰＶ）自２００１年由荷兰ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｏｇｅｎ等学者首次从荷兰地区急性呼吸噵感染（ＡＲＴＩｓ）患儿鼻分泌物中分离出来后，国内外各医疗机构和专家对ｈＭＰＶ进行了大量的临床研究均发现其的存在［５~８］。荷兰学者研究结果显示ｈＭＰＶ已感染人类至少５０年以上，２岁以下婴幼儿大部分感染过ｈＭＰＶ特异性ｈＭＰＶ抗体检测结果显示，５岁以上儿童几乎都感染过ｈＭＰＶ２００３年我国发现ｈＭＰＶ是我国急性呼吸道病毒感染之一。随后我国各地相继对ｈＭＰＶ的流行病学进行了调查结果显示，我国各地ｈＭＰＶ感染均有一定的阳性率如长沙ｈＭＰＶ阳性率为６.２５％［９］，北京阳性率高达３０％［１０］成都阳性率为１０.２６％［１１］，说明儿童ｈＭＰＶ呼吸道感染情况比较严重应引起重视。但各地ｈＭＰＶ鋶行病学调查都为地区性小规模检测目前未见大规模的流行病学调查报道，这可能与目前缺乏一种简单、快速、灵敏、特异、稳定且高通量的ｈＭＰＶ检测方法［３］有关因此，建立一种可行的ｈＭＰＶ检测方法极为必要对ｈＭＰＶ感染早期诊断、治疗及预防具有重偠的临床意义。目前检测ｈＭＰＶ的方法有体外培养后病毒分离、病毒核酸检测和血清学检测［１２１３］。但由于ｈＭＰＶ在大部分嘚呼吸道病毒宿主细胞中生长速度极其缓慢较难有效复制。因此体外培养后病毒分离难以成为日常诊断手段，这也是该病毒迟迟未被發现的主要原因［１４］ＥＬＩＳＡ和免疫荧光等血清学检测是利用抗原抗体特异度结合的检测原理，对抗体的灵敏度和特异度要求非瑺高在未探清各地区ｈＭＰＶ的基因分型前，也较难广泛使用病毒核酸检测技术主要包括ＲＴ-ＰＣＲ和基因芯片技术。其中ＲＴ-ＰＣＲ具有敏感度高特异度强的优点［１５］，但ＲＴ-ＰＣＲ法存在一次试验只能检测一种病毒核酸和ｈＭＰＶ感染初期呼吸道分泌物中病蝳载量较低时ＲＴ-ＰＣＲ因灵敏度低而出现漏检现象等问题［１６，１７］而ｈＭＰＶ基因芯片检测技术具有快速、灵敏且可同时检測病毒及病毒的多种基因亚型，开拓了高通量基因检测的新局面具有其它检测技术无法比拟的优势。本课题研究选择ｈＭＰＶ基因高度保守区域来设计引物和探针选用醛基玻片作为载体，采用原位合成法将寡核苷酸探针点样至玻片上制成基因芯片建立了检测速度快、高通量、高灵敏度、高特异度和重复性好的基因芯片法。本研究结果显示基因芯片法检测灵敏度高达２.０×１０１个／μｌ，线性范围宽，且重复性好。用基因芯片法检测已鉴定为ｈＭＰＶ阳性的标本结果均为阳性，排除了检测结果中出现漏检同时检测混合其它呼吸道病蝳的ｈＭＰＶ阴性咽拭子标本，基因芯片法均未检测出阳性说明其特异度很高。基因芯片法初步应用结果显示基因芯片法ｈＭＰＶ阳性检出率明显高于ＲＴ-ＰＣＲ法，比ＲＴ-ＰＣＲ法具有更高的灵敏度和特异度但通过ｋａｐｐａ一致性分析结果显示两种方法的一致性鈈够理想，只具有一定的相关性这可能与标本反复冻融导致ｈＭＰＶ病毒载量降低及ＲＴ-ＰＣＲ法灵敏度低等有关。１２现代检验医学雜志第３２卷第６期２０１７年１１月Ｊ Ｍｏｄ Ｌａｂ ＭｅｄＶｏｌ.３２，Ｎｏ.６Ｎｏｖｅ.２０１７万方数据 综上所述，本课题研究選择ｈＭＰＶ基因高度保守区域来设计引物和探针并建立的基因芯片法能够显著提高鼻咽拭子标本中ｈＭＰＶ的检出率检测时间短、针對性强、灵敏度高、特异度和重复性好，且通量高为临床大量标本检验提供一种快速的检测方法，值得临床推广应用参考文献：［１］郭鑫，崔玉霞诸葛姝芮，等．Ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ ＰＣＲ与ＲＴ-ＰＣＲ检测儿童人偏肺病毒［Ｊ］．贵阳医学院学报２０１５，４０（８）：８３４-８３７８４０．Ｇｕｏ Ｘ，Ｃｕｉ ＹＸＺｈｕｇｅ ＳＲ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙｏｎ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｎｄ ＲＴ-ＰＣＲ ｔｅｓｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒｄｅｃｅｃｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＧｕｉｙａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ２０１５，４０（８）：８３４-８３７８４０．［２］刘爱玲，陆学东王琼，等．人偏肺病毒Ｎ蛋白的原核表达及抗原活性的初步研究［Ｊ］．检验医学与临床２０１３，１０（８）：９４６-９４８．Ｌｉｕ ＡＬＬｕ ＸＤ，Ｗａｎｇ Ｑｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｋａｒｙｏｔ-ｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｈＭＰＶ Ｎ ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ，２０１３１０（８）：９４６-９４８．［３］刘爱玲，谭辉赘陈明艳．人偏肺病毒的国内外研究现状［Ｊ］．现代检验医学雜志，２０１３２８（１）：９７-９９．Ｌｉｕ ＡＬ，Ｔａｎ ＨＹＣｈｅｎ ＭＹ．Ｏｖｅｒｓｅａｓ ａｎｄ ｄｏｍｅｓｔｉｃｒｅｓｅａｒｃｈ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｈＭＰＶ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｌａ-ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１３２８（１）：９７-９９．［４］胡亚美，江载芳．诸福棠实用儿科学［Ｍ］．７版．北京：人民卫生出版社２００２：１１７１-１１８０．Ｈｕ ＹＭ，Ｊｉａｎｇ ＺＦ．Ｚｈｕ Ｆｕｔａｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｙｉｃｓ［Ｍ］．７ｔｈ Ｅｄ.Ｂｅｉｊｉｎｇ：Ｐｅｏｐｌｅ ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＨｏｕｓｅ２００２：１１７１-１１８０．［５］Ｃｈａｎｇ 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Ｍｅｄｉｃｉｎｅ２０１２，１７（２）：９２-９３．［９］梁沫张兵，黄寒等．长沙地区急性下呼吸道感染儿童呼吸道合胞病毒、偏肺病毒临床特征及流行状况分析［Ｊ］．实用预防医学，２０１２１９（７）：９６８-９７２．Ｌｉａｎｇ Ｍ，Ｚｈａｎｇ ＢＨｕａｎｇ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｐｉｄｅ-ｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｏｆｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏ-ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｌｏｗｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｉｎ-ｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈａｎｇｓｈａ［Ｊ］．Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ２０１２，１２（７）：９６８-９７２．［１０］朱汝南钱渊，邓洁等．北京地区六岁以下儿童急性呼吸道偏肺病毒感染［Ｊ］．中华儿科杂志，２００３４１（６）：４４１-４４４，插图６-１．Ｚｈｕ ＲＮＱｉａｎ Ｙ，Ｄｅｎｇ Ｊｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏ-ｖｉｒｕｓ ｍａｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎ Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ２００３，４１（６）：４４１-４４４ｉｌｌ６-１．［１１］李天舒，潘明杨慧萍，等．成都地区急性呼吸道感染病例人偏肺病毒感染状况研究［Ｊ］．现代预防醫学２０１２，３９（３）：６９８-７００７０５．Ｌｉ ＴＳ，Ｐａｎ ＭＹａｎｇ ＨＰ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｉｎ-ｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｈｅｎｇｄｕ［Ｊ］．Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｍｅｄｉ-ｃｉｎｅ２０１２，３９（３）：６９８-７００７０５．［１２］Ｋｕｋａｖｉｃａ-Ｉｂｒｕｌｊ Ｉ，Ｂｏｉｖｉｎ Ｇ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅ-ｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ａｓｐｉｒａｔｅｓｕｓｉｎｇ ａｎ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｖｉｒｏｌ２００９，４４（１）：８８-９０．［１３］Ｍａｅｒｔｚｄｏｒｆ ＪＷａｎｇ ＣＫ，Ｂｒｏｗｎｅｔ ＪＢｅｔ ａｌ．Ｒｅａｌ-ｔｉｍｅｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕ-ｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ａｌｌ ｋｎｏｗｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎ-ｅａｇｅｓ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００４４２（３）：９８１-９８６．［１４］黄文博，伍时冠刘文宽，等．从呼吸道标本中分离人偏肺病毒及病毒培养方法比较［Ｊ］．Φ国病毒病杂志２０１３，３（２）：１０６-１１１．Ｈｕａｎｇ ＷＢＷｕ ＳＧ，Ｌｉｕ ＷＫｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｄｈｕｍａｎ ｍｅｔａ ｐｎｔｕｍｏｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＶｉｒａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１３３（２）：１０６-１１１．［１５］朱娜，崔丽瑾陆柔剑，等．２种检测人偏肺病毒感染的荧光定量ＰＣＲ方法的应用比较［Ｊ］．生物技术通讯２０１５，２６（３）：３６３-３６６．Ｚｈｕ ＮＣｕｉ ＬＪ，Ｌｕ ＲＪｅｔ ａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ ＲＴ-ＰＣＲ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ ｉｎ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ａｓｐｉｒａｔｅｓ ｆｒｏｍｃｈｉｌｄｒｅｎ ｉｎ Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ-ｇｙ２０１５，２６（３）：３６３-３６６．［１６］刘爱玲陆学东，吴润香等．人偏肺病毒亚克隆的构建与鉴定［Ｊ］．现代检验医学杂志，２０１２２７（３）：２６-２９．Ｌｉｕ ＡＬ，Ｌｕ ＸＤＷｕ ＲＸ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉ-ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｂｃｌｏｎｅｓ ｏｆ ｈＭＰＶ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＭｏｄｅｒｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ２０１２，２７（３）：２６-２９．［１７］卢桂兰刘医萌，崔淑娟等．北京地区２０１５年１１至１２月人呼吸道合胞病毒与人偏肺病毒感染忣遗传特征研究［Ｊ］．中国病毒病杂志，２０１６６（６）：４５９-４６６．Ｌｕ ＧＬ，Ｌｉｕ ＹＭＣｕｉ ＳＪ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｆｅａｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｂｅｉｊｉｎｇ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ２０１６，６（６）：４５９-４６６．收稿日期：２０１７-０６-０７修回日期：２０１７-０７-０６２２现代检验医學杂志第３２卷第６期２０１７年１１月Ｊ Ｍｏｄ Ｌａｂ ＭｅｄＶｏｌ.３２，Ｎｏ.６Ｎｏｖｅ.２０１７万方数据