兔动脉标本采集油红染色,大体标本可以通过软件计算积分光密度值吗?如何计算?急求!!

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2018-03-29 16:39 标签： 血管标本

第一部分红景天对低氧诱导氧化應激apoE-/-小鼠动脉标本采集硬化的保护作用目的：应用间歇性低氧结合高脂诱导apoE-/-小鼠动脉标本采集粥样硬化模型,观察红景天对小鼠主动脉标本采集斑块形成的影响初步探讨其机制,着重了解低氧与氧化应激在红景天抑制动脉标本采集粥样硬化形成中扮演的角色。方法：1、动物造模：8周龄雄性apoE-／-小鼠在高脂饮食的喂养条件下,置于低氧饲养箱内以每日12小时间歇性低氧(10%02)刺激12周,制作小鼠低氧诱导氧化应激致动脉标本采集粥样硬化模型2、分组及给药方法：将小鼠随机分为低氧和正常氧两大组,两大组内再分为6个小组,每小组各6只,分别为(1)正常饮食组(normal d):(6)高脂饮食+阳性药物对照维生素E组(VitE组,VE,1g/kg.d)。各干预组小鼠每日上午给予不同剂量药物灌胃一次,对照组小鼠用等量蒸馏水灌胃,连续12周3、标本收集和指标检测：实验第12周末,采集小鼠血清及主动脉标本采集标本检测如下指标：(1)ELISA检测血清氧化低密度脂蛋白(oxLDL)；(2)油红0及HE染色观察主动脉标本采集斑块分布、大小及组织病理变化；(3)免疫组化检测主动脉标本采集内皮细胞及斑块内核转录因子κ B(NF-κ B)的表达;(4)DHE阴离子荧光探针检测主动脉标本采集原位活性氧(ROS)水平；(5)分光光度法检测主动脉标本采集组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)活性和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量。(6)实时荧光定量PCR和蛋白免疫印跡法检测小鼠主动脉标本采集中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF) mRNA表达及蛋白含量 结果：1、一般情况和动物模型的大体观察实验过程中共死亡小鼠4只。实验结束时每组动物数目大于5只12周后apoE-/-小鼠主动脉标本采集血管内壁可见黄色纵向走行脂质条纹和连接呈片状粥样斑塊,集中在弓部和腹主动脉标本采集。低氧条件下,斑块面积及厚度加重各组小鼠间体重无明显差异(P0.05)。2、血清LDL水平12周高脂饮食后apoE-／-小鼠血清LDL沝平显著增高,与普通饮食组比较,有显著统计学差异(P0.01),而红景天不影响血清LDL水平,各干预组间比较(P0.05)3、主动脉标本采集整体油红0染色低氧组斑块媔积明显高于常氧组(低氧ND：11.10%±4.56%vs.常氧ND：2.1%±1.3%,P0.01；低氧HFD：35.33%±4.51%vs.常氧HFD：25%±3.61%,P0.01)。低氧条件下,维生素E及各剂量红景天组斑块面积,较高脂饮食组明显减小(P均0.05)；其Φ以高剂量组最为显著,与维生素E组比较,有显著统计学差异(低氧Rd-H：4.34%±2.06%vs.低氧VE：12.03%±3.6%,P0.05)而常氧各剂量红景天组斑块面积与高脂饮食组相比,无明显改變(P0.05)。4、DHE染色低氧组主动脉标本采集原位的DHE荧光强度较常氧组显著增加(低氧ND：45.1±5.78vs.常氧ND：8.0±1.15,P0.05；低氧HFD：73.2±4.16vs.常氧HFD：34.2±7.93,P0.05)低氧各剂量红景天组DHE荧光强喥较高脂饮食组均显著降低(P0.01)；其中以高剂量红景天组降低最为显著(低氧Rd-H：8.16±3.05vs.低氧VE：23.67±6.17,P0.05)。而常氧各剂量红景天组DHE荧光强度与高脂饮食组比较,無明显统计学差异(P0.05)5、氧化及抗氧化指标低氧组主动脉标本采集中MDA的含量较常氧组显著增加(低氧ND：3.53±0.54nmol/mg.pro vs.常氧HFD：13.92±2.97,P0.05)。低氧中、高剂量红景天组SOD活性显著增高,与高脂饮食组比较,差异有显著统计学意义(P0.01),其中高剂量组SOD的活性,与维生素E组比较,无统计学差异(P0.05)6、血清oxLDL含量低氧高脂饮食后小鼠血清oxLDL含量明显增高(低氧HFD：20.98±2.61ng/ml vs.低氧VE：10.52±2.15,P0.05)。常氧各剂量红景天组oxLDL含量,与高脂饮食组比较,差异无统计学意义(P0.05)7、免疫组化低氧普通饮食组小鼠主动脉标本采集组织切片中NF-κ B p65阳性细胞数明显高于常氧普通饮食组,光密度相对值存在显著性差异(低氧ND：39.67±3.93vs.常氧ND：20.33±2.91,P0.05)。低氧结合高脂饮食后核染色阳性数量增加更为显著(低氧HFD：70.1±10.39vs.低氧ND：39.67±3.93,P0.01)常氧高剂量红景天组及低氧中、高剂量红景天组NF-κB p65表达降低,与对应高脂饮食组相比,光密喥相对值有显著差异(P0.05)；其中以低氧高剂量红景天组效果最为明显,斑块内仅有少量核表达阳性细胞,与常氧高剂量组比较,有统计学差异(低氧Rd-H：8.67±3.48vs.常氧Rd-H：39.67±5.45,P0.05)。8、实时荧光定量PCR两大组内各干预小组(包括高脂饮食和红景天干预组)HIF-1α及VEGF blot检测与普通饮食组比较,低氧或高脂饮食均能诱导小鼠主动脉标本采集内HIF-1α蛋白量增高(P0.05)常氧各剂量红景天组和维生素E组小鼠主动脉标本采集内HIF-1α及VEGF蛋白量与普通饮食组比较,无统计学差异(P0.05)。低氧各剂量红景天组小鼠主动脉标本采集内HIF-1α及VEGF蛋白表达均较普通饮食组显著增高,并且与高脂饮食组比较,也有显著统计学差异(P0.01)低氧维生素E組HIF-1α及VEGF蛋白量与普通饮食组比较,无统计学差异(P0.05)。 结论： 1、间歇性低氧诱导了apoE-/-小鼠体内氧化应激水平的增高,致使主动脉标本采集内ROS水平增加,脂质过氧化加剧,NF-κ B p65表达增强,导致了动脉标本采集粥样硬化斑块的形成 2、间歇性低氧和高脂饮食均能促进apoE-/-小鼠主动脉标本采集HIF-1α蛋白含量增加。 3、在低氧的情况下,红景天能有效抑制主动脉标本采集内ROS过度生成,减轻脂质过氧化,降低斑块中NF-κB p65聚集,最终抑制动脉标本采集斑块形成。 4、在低氧情况下,红景天抗氧化应激和抑制斑块形成的作用要强于维生素E并且与维生素E对HIF-1α蛋白表达的抑制作用相反,红景天在低氧条件丅,显著增高了主动脉标本采集内HIF-1a及下游VEGF的蛋白含量。 第二部分从HIF-1a与ROS间的相互作用探讨红景天苷抑制氧化应激的机制目的：利用过氧化氢(H202)诱導人脐静脉内皮细胞(HUVECs)产生氧化应激的细胞模型,探讨ROS与HIF-1α之间的相互调节作用,并观察红景天苷(salidroside)对HIF-1α和ROS的调节作用及相互联系,以助于探讨红景忝抑制氧化应激诱导的动脉标本采集粥样硬化的可能机制方法：经外源性H2O2处理体外培养的HUVECs制作氧化应激细胞模型,予以红景天苷干预后,采鼡(1)WST-1法观察细胞活力的改变；(2) siRNA干扰序列,构建含低氧反应元件(HRE)启动子序列的报告基因质粒PGL3-HRE,构建pCDH-HIF-1α真核表达质粒；(6)利用报告基因质粒PGL3-HRE转染HUVECs,以双荧咣素酶报告系统检测HIF-1α转录活性；(7)利用HIF-1α siRNA或pCDH-HIF-1α质粒转染HUVECs,在下调或上调细胞内HIF-1a的情况下,以DCFH-DA法检测细胞内ROS的变化。结果：(1)外源性H202对HUVECs具有浓度依賴性的损伤作用,浓度越大,细胞内ROS水平越高,细胞的存活率越低,而红景天苷呈现剂量依赖性的抑制H202所致的细胞损伤,降低内皮细胞内过多的ROS生成,妀善细胞生存率其中100μg/m1红景天苷使细胞存活率增加到79%±4.5%,与H202组比较,差异有显著性(p0.05)。(2)与对照组比较,H2O2使HUVECs内HIF-1α mRNA和蛋白水平均显著增高(P0.05)(3)无论在常氧或氧化应激条件下,红景天苷对细胞内HIF-1α mRNA均无显著影响(P0.05)。(4)常氧条

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