ABI供稿，生物通翻译
在收获组织及细胞死亡之后，应立即灭活内源的RNA酶，以防止RNA降解。&&& 以下3个方法均可有效使内源RNA酶失活：1）用含离液（如胍盐）的细胞裂解液收获样品，并立即匀浆。2）用液氮瞬间冻结样品。值得特别注意的是：组织块必须保证足够小，在浸入液氮的瞬间就能冻结，以确保瞬间令RNA酶失活3）立即将样品置于中。它是一种水相、无毒的收集试剂，能立即稳定并保护完整、未冻结的组织和细胞样品中的RNA。关键要点是组织样品切片一定要够薄（&0.5 cm），这样才能在RNase破坏RNA之前迅速渗入组织块中。&
使用正确的细胞或组织储存条件&&& 在样品用液氮瞬间冻结之后，应该储存在-80°C，千万不能解冻。即使是置于含有胍盐的裂解液中作匀浆前的短暂解冻，也会导致RNA的降解和损失。瞬间冻结的组织应该首先在超低温条件下先研磨成粉，然后置于裂解液中进行匀浆。&&& RNAlater使样品储存更为便利。储存在中的细胞或组织可在室温下稳定保存长达1个星期，在4°C可稳定保存长达1个月，或永久保存在-20°C。有关的更多信息请参考 .&
彻底匀浆样品&&& 细胞或组织的彻底匀浆对RNA提取来说，是一个很关键的步骤，它能够防止RNA的损失和降解。匀浆的方法应根据细胞或组织的类型来选择。大部分培养的细胞可以置于细胞裂解液中，通过简单的涡旋震荡来匀浆；而动物组织、植物组织、酵母和细菌则常常需要更加剧烈的方法。比如说细菌的细胞壁，就需要酶消化来实现彻底的细胞裂解和RNA的最大回收。有关各种不同的样本类型，哪些方法是最适合的匀浆方法，请参考 .&
在RNA提取之前预处理样品裂解液&&& 对于某些样品来说，在匀浆之后，RNA提取之前，还需要一些额外的处理步骤。对于脂肪含量高的组织，像脑组织和脂肪组织得到的裂解液，就需要通过氯仿抽提来去除脂类，从而提高RNA产量。许多植物组织中富含多酚和多糖，会降低RNA的质量和产量，用预处理裂解液可去除这些难以处理的成分。&
选择最好的RNA分离方法&&& 现有众多的RNA分离方法也许令人难以取舍。目前最简单也是最安全的方法是柱式分离，如或。因为操作简单，所以这些步骤特别适用于同时处理多个样品。如果是处理复杂的组织，如富含核酸酶（胰腺）或脂肪（脑和脂肪组织）的样品，就推荐使用更加严格的、基于酚处理的RNA分离方法，如。更多的信息请参考
。更多方法选择，请参考
DNase处理&&& 如果提取的RNA将用于RT-PCR，我们推荐用DNase处理纯化的RNA样品以去除残留的DNA污染。当样品来源于富含DNA的组织，如脾脏时，DNase处理也是一个好办法。Ambion的的实验流程中包含了DNase处理的步骤，并提供了必需的试剂（DNA酶I）。 则可用于去除用各种方法制备的RNA样品中的DNA污染。这两个产品都提供了高质量的DNase I，优化的反应缓冲液，和DNA酶消化处理后简单快速去除DNase的方法，无需使用有机溶剂和热处理。&
减少环境RNase的暴露&&& 为了得到完整的、高品质RNA，在整个RNA制备过程中，当RNA离开强蛋白变性剂（如离液裂解液或酚）的保护时，避免引入新的RNase污染就非常关键。由于RNase几乎是无所不在，所以必须确保与纯化的RNA接触的每一样东西都是无RNase污染的。所有的表面，包括移液器、工作台、玻璃器皿和制胶设备，都必须用表面去污净化溶液如来处理过。必须保证一直使用，手套也应经常更换。&
正确的沉淀&&& 纯化得到的RNA可能需要通过沉淀来浓缩，以满足一些下游应用的需要。醋酸铵(NH4OAc) 沉淀（加0.1体积的5 M 醋酸铵、2-2.5体积的无水乙醇，-20°C放置25分钟以上）可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低浓度的RNA（ng/ml），可以采用共沉淀（如）的方法。当RNA用于RT-PCR分析时，线性的丙烯酰胺和DNase处理的糖原都可以作为理想的共沉淀剂，因为它们都不含DNA污染。酵母RNA和未处理的糖原会给样品带来核酸污染，有可能影响RT-PCR的结果。沉淀后，注意避免RNA沉淀过分干燥，因为这可能导致很难重新溶解。&
重悬&&& 许多RNA提取步骤的最后一步是溶解纯化的RNA沉淀。理想的重悬溶液应该满足3点要求：无RNase污染、较低的pH值（pH 6-7）、含有螯合剂，以保护RNA不受带入的RNase的降解。（能满足以上所有标准。）为了帮助溶解，RNA沉淀可置于重悬溶液中在65°C孵育5分钟，并不时轻摇以帮助溶解。&
储存&&& 如果只是短期储存，重悬的RNA应放置于-20°C；如果是长期储存的话，就应该放置于-80°C。尽管重悬于水或缓冲液中的RNA也可以储存在-80°C，但保存于醋酸铵/乙醇溶液中的RNA沉淀则更加稳定。我们推荐将RNA溶液分装在几支管中。这会避免反复冻融损伤RNA，并预防偶然的RNase污染。
ABI供稿，生物通翻译&买一送一产品列表
AM1912 RNAqueous& Kit
100-107细胞或者1-75mg组织
AM1931 RNAqueous&-Micro Kit
10-105细胞或小于10mg组织，适用于LCM样品
AM1911 RNAqueous&-Midi Kit
107-108细胞或者0.1-0.5g组织
AM1920 RNAqueous&-96 Kit
高通量离心法RNA抽提试剂盒&
AM9690 Plant RNA Isolation Aid
植物样品辅助剂，配合RNAqueous系列产品使用&
AM1924 RiboPure™ Kit
包含Trizol与GFF膜法抽提试剂盒，适用于最高要求的RNA实验的抽提制备，每次可抽提2x106细胞或100mg以内的组织样品&
AM1925 RiboPure™-Bacteria Kit
细菌RNA抽提试剂盒，每次可抽提108-109细菌细胞
AM1926 RiboPure™-Yeast Kit
酵母RNA抽提试剂盒，每次可抽提108-109酵母细胞&
AM1983 MELT™ Total Nucleic Acid Isolation System
包含Melt超级破碎系统，无需研磨，简单几分钟破碎裂解样品，使您不再需要砚钵与研磨棒
AM1975 RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE
有效从FFPE样本中纯化RNA与DNA的试剂盒
AM1921 PARIS™ Kit
同时抽提RNA、DNA与蛋白质，并包含胞核胞质分离buffer
血液抽提试剂盒
AM1928 RiboPure™-Blood Kit
30分钟抽提0.3-0.5ml血液总RNA，包含RNAlater，保护全血防止RNA降解&
AM1951 Mouse RiboPure™-Blood RNA Isolation Kit
&抽提0.1-0.5ml小鼠血液总RNA，包含microRNA，试剂盒含RNAlater，保护全血防止RNA降解
AM1923 LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System (1933 + 1934)
包含创新的白细胞分离系统，可免去离心分离之苦，一次可处理9-10ml血液；包含RNAlater，保护分离的白细胞RNA不被降解
磁珠法抽提试剂盒
AM1840 MagMAX™ Total Nucleic Acid Isolation Kit
100 rxns &
磁珠法抽提试剂盒，可抽提RNA 与DNA,无需离心步骤，更加简便简洁&
AM1830 MagMAX™-96 Total RNA Isolation Kit
96孔板高通量磁珠法RNA抽提试剂盒，无需离心，适合同时抽提大量样本，可配合高通量移液系统使用
AM1837 MagMAX™-96 Blood RNA Isolation Kit
96孔板高通量磁珠法RNA抽提试剂盒，无需离心，适合同时抽提大量血液样本，可配合高通量移液系统使用
AM1939 MagMAX™ Viral RNA Isolation Kit
适合从各种样本中抽提病毒RNA，无需离心，更好的产量与重复性
AM1929 MagMAX™ AI/ND Viral RNA Isolation Kit
禽流感与新城病毒抽提试剂盒，适合从各种样本中抽提低浓度AI/ND病毒，美国国家畜牧服务实验室NVSL推荐
AM1835 MagMAX™-96 AI/ND Viral RNA Isolation Kit
4 x 96 prep&
禽流感与新城病毒抽提试剂盒，适合从各种样本中抽提低浓度AI/ND病毒，美国国家畜牧服务实验室NVSL推荐，适合大量样本同时抽提，可配合高通量移液系统使用&
mRNA抽提与纯化
AM1919 MicroPoly(A)Purist™ Kit
PolyApurist，是目前效率最好的mRNA纯化技术，可从108细胞、50 mg组织或2C400 μg总RNA中纯化mRNA,极低rRNA残留
AM1916 &Poly(A)Purist™ Kit
PolyApurist，是目前效率最好的mRNA纯化技术，可从0.2C2mg总RNA中纯化mRNA,极低rRNA残留
AM1922 &Poly(A)Purist™ MAG Kit
from up to 8 mg total RNA
PolyApurist，是目前效率最好的mRNA纯化技术，可从多至8mg总RNA中纯化mRNA，无需离心，操作更简便,极低rRNA残留
AM10020 Oligo(dT) Cellulose
传统的Oligo(dT)数脂，可用于从总RNA中纯化polyA RNA
AM7020&RNAlater
原价￥1402.5
AM7021 RNAlater
原价￥4158&
现价￥2574
AM9738&Tri-reagent
原价￥1898&
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如何对提取后的总RNA 进行质量测定
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测OD值,A260/280为1.8-2.0之间说明纯度可以,还可将RNA跑个电泳,一般来说要有较清晰的三条带,分别为5s,18s,28s rRNA,如果条带弥散看不清,说明RNA有降解现象.
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其他类似问题
扫描下载二维码RNA质量及RNA样品评估
Melanie Palmer and Ellen Prediger
本文是关于RNA质量及RNA样品评估的一系列专栏的第一篇。后续文章请继续关注新发布的技术说明。
由于mRNA在总RNA样品中仅占1-3%，因此检测起来并不容易，即使使用最敏感的方法也是如此。另一方面，核糖体RNA则占总RNA样品80%以上，其中大多数是由28S和18S rRNA组成的（在哺乳动物系统中）。过去对mRNA质量进行评估的方法是先对总RNA进行电泳，然后使用溴化乙锭染色（参见右侧的变性凝胶电泳）。该方法的依据是假设rRNA的质量和数量可以反映潜在的mRNA质量和数量。由于哺乳动物28S和18S rRNA的长度大约分别为5kb和2kb，所以理论上28S:18S的比率应该大约为2.7:1；但长期起来人们使用2:1的比率作为鉴定完整RNA的标准。虽然易降解的28S和18S rRNA条带可以暗示RNA的完整性，但这些长寿命的大量分子如何真实反映潜在的mRNA质量仍然不甚明了，因为mRNA的周转期要快很多。
肉眼评估琼脂糖凝胶中28S:18S rRNA的比率是比较主观的，因为rRNA条带的外观会受电泳条件、RNA上样量以及溴化乙锭荧光饱和度等条件的影响（图1）。Agilent 2100生物分析仪是一种用于总RNA分析的改进工具，它结合使用微流体、毛细管电泳和荧光来评估RNA浓度及完整性。该工具的另一优点所需的上样量极少，用户可以对有限样品的RNA质量进行评估。在Ambion，我们使用该工具来评估我们预制RNA的质量。另外，我们还使用它来检测总RNA谱与mRNA完整性之间的关系。下文我们将对部分结果进行讨论。
图1、不同组织的RNA表达谱。 分别使用多步酚萃取和玻璃纤维滤膜结合的方法来提取人心脏总RNA (100 ng) (A)和HeLa细胞系总RNA (B)，并使用变性琼脂糖凝胶（插入图片）和Agilent生物分析仪进行检测。其中，心脏样品的28S:18S rRNA比率为1.51，HeLa细胞样品的28S:18S rRNA比率则为1.72。
rRNA处理 除了从培养细胞提取的RNA样品外，使用Agilent生物分析仪进行检测总RNA时, 很少能够得到2.0或更高的28S:18S rRNA比率（图1、2、3）。Ambion认为这与28S rRNA相比18S RNA而言结构较不稳定有部分关系。28S rRNA的不稳定性可能是由于其长度以及二级和三级结构更多造成的。事实上，部分23S和28S rRNA带有富含AU的序列（称为“隐裂”），这种序列会导致这些种类的rRNA断裂为两段更小的RNA。这类过程的分子机制尚不清楚，但很有可能类似的结构特点正是哺乳动物28S rRNA相比18S rRNA具有“超敏性”的原因，从而使得28S:18S rRNA的比率低于理论上的2.7:1。
图2显示了生物分析仪检测出的提取自5例不同的人前列腺样品的总RNA谱，这些样品表现出逐渐降低的28S:18S rRNA比率。从图上可以看出，当28S rRNA峰的面积减少，即表示断裂时，首先在18S和28SrRNA之间的基线处出现了上升，然后在18S rRNA下方的基线区域同样出现了上升，并且在28S rRNA片段变得更小时这种变化逐渐扩散。但是，除了核酸降解程度最大的样品 (panel E) 外，所有其他样品的18S rRNA峰仍接近保持不变，这表明其与RNA样品大规模降解并不相关。然而，这种情况看起来是由于28S rRNA相对其他RNA发生断裂造成的。事实上，即使当样品的28S rRNA谱发生了相当程度的降解时，18S rRNA和mRNA可能仍然保持完整。
图2、28S rRNA片段的断裂。 Agilent生物分析仪在28S rRNA渐进式降解的不同时间点对提取自人前列腺的总RNA（100ng）进行了检测。
一般来说，强调保护RNA质量主要针对组织保存和破碎的方法，其目标是使这些步骤中的RNase活性尽可能低。然而，对RNA质量影响最为重要的因素其实是组织分离时的生理状态，而迄今为止这一点常常被忽略。从人组织中提取RNA常常表现出与操作实验动物时不同的困难，相关因素主要包括死亡前组织的生理状态（即濒死期）以及验尸间隔（从死亡到组织收集间的时间间隔）等。另外，在进行保存前可能还有额外的延误，尤其在临床过程中，因为活体切片和器官移植是最优先的。总的来说，这些因素基本确定了人的总RNA很少具有2.0的28S:18S rRNA比率。不幸的是，这些因素是不可避免的，而且在评估RNA质量时也很少被考虑到。
rRNA比率的组织特异性差异 Ambion还发现rRNA的比率在某种程度上与组织来源有关。这可能反映了不同组织对死亡前及死亡后生理压力的特异性响应。例如，某些组织中rRNA的比率较低，如肝或肺，这一点在小鼠、大鼠或人的组织中都有体现；其他组织，如脾等，则表现得较有弹性。图3显示了生物分析仪对来自不同人体组织的总RNA进行的检测，其结果证明了这种现象。需注意的是，所有的总RNA样品均具有相对较低的基线，即使rRNA比率在1.95至1.2之间变动。大多数谱图在24到29秒间有较小的荧光峰，其对应着5S rRNA和其他小RNA。这些小RNA并未被断裂产物掩盖，因此说明RNA基本是完整的。使用GAPDH探针对这些样品进行的Northern blot分析检测到了在约1.4kb处的清晰条带，这证明所有的样品均具有完整mRNA（数据未展示）。
图3、不同人组织的总RNA谱变化。Agilent生物分析仪对上图所示的人的不同组织的总RNA（100ng）进行了分析，这些RNA是通过大规模制备方法，经多步酚萃取及LiCl沉淀和DNase处理和纯化回收而得到的。虽然这些RNA样品具有不同的28S:18S rRNA比率（参见每条panel描述），但经过GAPDH探针的Northern分析证明它们的mRNA均是完整的（数据未展示）。
现今并没有一种简单的衡量标准来预计mRNA是否完整，尤其是针对有限的样品。Agilent 2100生物分析仪是一种可以对组成总RNA的主要组分进行更清晰评估的工具，还可以对它们随来源、时间及保存方式产生的变化进行评估。不过，rRNA谱与mRNA完整性之间的关系仍不清楚。当然，总RNA具有2.0的28S:18S rRNA比率还是意味着高质量，但是具有较低rRNA比率的总RNA不一定质量就差，这一点对大多数总RNA都是适用的。
为确保Ambion为客户提供最高质量的人源RNA，我们对人总RNA进行了大量研究，以分析rRNA比率不同对潜在的mRNA的影响。我们使用了包括Northern blot分析、首链及次链cDNA合成、aRNA合成、检测微阵列芯片以及实时定量PCR等分析方法。我们获得的数据表明，具有较低28S:18S比率的RNA足以胜任大多数应用需求。这至少可以宽慰部分仍然努力想办法从始终只能获得1.6比率的组织中提取得到rRNA比率为2.0的样品的科学家。事实上，这类样品一般确实可以在aRNA扩增及Northern分析中得到良好的结果。
一般来说，28S:18S rRNA比率&1.0，且18S及5S rRNA或纳米标记物之间的基线较低的总RNA样品对于绝大多数要求严格的应用都是适用的。通过大量分析我们发现，在进行前文所述评估中，除完整性以外，最重要的因素就是纯度。由于大多数RNA都会用于下游的酶促应用，残留污染对于获得的cDNA或aRNA的质量会带来极大影响。如果样品含有残留有机物、金属离子或核酸酶，即使最完整的的RNA也不会带来好的实验结果。为了确保您的RNA不含这些会影响完整性的污染，您可以进行简单的稳定性测试，将少量RNA孵育在37°C下数个小时至过夜，然后与保存在-20°C下的平行样品进行比较。保存在37°C下的样品相比保存于-20°C下的样品应表现出最低限度的28S:18S比率降低。一般来说，随时间延长rRNA比率变化超过20%的样品在下游应用的表现可能不会很好。
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赛默飞世尔科技（中国）有限公司地址(中国总部)：上海市浦东新区新金桥路27号3& 6& 7号楼
电话：86-21-如何确认RNA的质量_百度知道
如何确认RNA的质量
一般通过总量，纯度与完整性三大项检测来确认RNA质量： 1总量：微量分光光度计测260nm吸收值计算。2纯度：微量分光光度计测260nm/230nm吸收值的比值，用于评估有机溶剂残留；260nm/280nm吸收值的比值，用于评估蛋白质污染比例。3完整性：以Agilent Bioanalyzer进行毛细管电泳(capillary electrophoresis)，并以软件的RIN(RNA Integrity Number)分数评估，10为RNA完整性最好，0为最差。RNA质检参数中260、280、320、230nm下的吸光度分别代表了核酸、蛋白质、盐浓度和有机溶剂的值。其中：A230: 测定其它碳源物质，如酚，糖类等。A260：核酸的吸收峰测，测RNA，DNA，引物等的浓度用的。A280：蛋白质的吸收峰。一般的，我们只看OD260/OD280(Ratio，R)在1.8~2.1范围内时，我们认为 RNA中蛋白的污染是可以容忍的，不过要注意，当用 Tris 作为缓冲液检测吸光度时，R 值可能会大于 2（一般应该是&2.2的）。当R & 1.8时，溶液中蛋白的污染比较明显，可以根据自己的需要决定这份RNA 的命运。当R & 2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了，而纯RNA的OD260/OD280的比值为2.0。
英语爱好者
R值可能会大于2（一般应该是&lt，则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好.4，比较两者的电泳条带，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后续的实验中就会有非常适合的环境和时间发挥它们的作用了.0！ 以下两种方法.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，其值大于2，当然这时你的实验也就完了。 下面，我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。 3）保温试验 方法很简单的，它们的条带也要符合方法2中的条件）。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。 时间到了之后，取出两份样本进行电泳;2.2的），乙醇沉淀RNA，所以希望大家自己多多思考啊;A280的比值为2，但是根据我的经验，如果你仅仅是为了检测RNA的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的，用普通的琼脂糖胶就可以了，RNA的电泳都是用变性胶进行的;1.0表明裂解液中有亚硫氰胍和belta-巯基乙醇残留，我是这样想的，我可以看到的资料或者是厂家的说明书，各位也同样可以看到的，相信大家都知道的： 1）检测RNA溶液的吸光度 280，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。 电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰。电泳完成后？或许各位非常关心呢;mlssRNA。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1h，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0，以下同）是非常困难。A260/A230的比值还表明RNA的纯度，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。当R&2.2时、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好的。 以上是我们常用的两种方法，但是这两种方法都无法明确的告诉我们RNA溶液中有没有残留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我们很难察觉，但是大部分后续的酶学反应都是在37度以上并且是长时间进行的。这样，需用乙酸盐、背景（溶液浑浊度）。 1.82,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖、230。相反的。 2）RNA的电泳图谱 一般的如何确认RNA的质量 提取到质量良好的RNA（包括总RNA和mRNA、320.5 ml的离心管中。 如果你的RNA样本通过了保温实验的检测并且你在后续的实验中还是非常小心的防范RNA酶的骚扰，那么你的实验应该是很难失败了。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，关于RNA的提取技术，我就不说了，为什么呢，说明RNA已经水解成单核酸了。 如果RNA的量够，可在260nm（A260）用分光光度法测定RNA的得率，1个单位等于40ug&#47.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显。当R&lt，内容当然都是一样的了，所以实验做的好不好，主要是心的投入多少的问题、260nm下的吸光度分别代表了核酸、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R），其值小于2。纯RNA的A260&#47
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