操作步骤/双水相萃取
一、重点双水相萃取放大容易：一般10ml离心管的实验结果可直接放大到工业规模。具体实验步骤：1、配制一系列不同浓度、pH及离子强度的双水相，每个双水相改变一个参数。2、加入料液，再加水使整个系统质量达到5~10g。离心管封口后充分混合。3、g下离心3－5min，使两相完全分离。4、用吸管或移液管将上相和下相分别吸出，测定上、下相中目标产物的浓度或生物活性，计算分配系数。5、上、下两相中目标产物的总量应与加入量对比，以检验是否存在沉淀或界面吸附现象，并可确认浓度或活性测定中产生的系统误差。6、分析目标产物的收率和纯化倍数，确定最佳双水相系统。二、特点：1、含水量高（70%～90%），适宜提取水溶性的蛋白质、酶等生物活性物质，且不易引起蛋白质的变性失活。2、不存在有机溶剂残留问题。3、易于放大，各种参数可按比例放大而产物收率并不降低。这是其他分离技术无法比拟的。 定义two aqueous phase extraction萃取是在两个液相间进行。大部分萃取采用一个是水相。另一个是有机相。但有机相易使蛋白质等生物活性物质变性。最近，发现有一些高分子水溶液（如分子量从几千到几万的聚乙二醇硫酸盐水溶液）可以分为两个水相，蛋白质在两个水相中的溶解度有很大的差别。故可以利用双水相萃取过程分离蛋白质等溶于水的生物产品。例如用聚乙二醇（PEG Mr为6000）/磷酸钾系统从大肠杆菌匀浆中提取β-半乳糖苷酶。这是一个很有前途的新的分离方法，特别适用于生物工程得出的产品的分离。
原理/双水相萃取
某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可以形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成双水相系统（aqueous two-phase system,ATPS）。利用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性质，Albertsson于20世纪50年代后期开发了双水相萃取法（aqueous two-phase extraction），又称双水相分配法。20世纪70年代,科学家又发展了双水相萃取在生物分离过程中的应用，为蛋白质特别是胞内蛋白质的分离和纯化开辟了新的途径。双水相萃取的聚合物不相容性：根据热力学第二定律，混合是熵增过程可以自发进行，但分子间存在相互作用力，这种分子间作用力随相对分子质量增大而增大。当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对分子质量较大的分子间的排斥作用与混合熵相比占主导地位，即一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相溶性。可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dx）,聚丙二醇/聚乙二醇，甲基纤维素/葡聚糖。双水相萃取中采用的双聚合物系统是PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。另外，聚合物与无机盐的混合溶液也可以形成双水相，例如，PEG/磷酸钾（KPi）、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于双水相萃取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG,下相富含无机盐。生物分子的分配系数取决与溶质于双水相系统间的各种相互作用，其中主要有静电作用、疏水作用和生物亲和作用。因此，分配系数是各种相互作用的和。
体系分类/双水相萃取
高聚物/高聚物双水相体系 高聚物/无机盐双水相体系 低分子有机物/无机盐双水相体系 表面活性剂双水相体系
应用/双水相萃取
1、蛋白质、酶的纯化2、多肽的分离纯化3、核酸的分离纯化
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贡献光荣榜木瓜蛋白酶在PEG/硫酸铵、PPG/离子液体双水相中分配行为的研究--《海南大学》2015年硕士论文
木瓜蛋白酶在PEG/硫酸铵、PPG/离子液体双水相中分配行为的研究
【摘要】：木瓜蛋白酶因其具有强的水解能力和适应性,被广泛的应用在食品和药品等领域,但是传统用于分离纯化木瓜蛋白酶的方法不能满足高纯度木瓜蛋白酶的需求,加强对木瓜蛋白酶提纯方法的研究具有非常重要的应用价值。双水相作为一种温和、高效的分离技术,被广泛的应用于生物活性物质的分离与纯化。但是,目前,对于双水相系统的研究大多都集中在系统优化方面,对于PEG/硫酸铵双水相系统的关联、PPG/离子液体的研究较少。本文测定了双水相系统液液相平衡的数据并用经验方程对其进行了关联,以木瓜蛋白酶为模型蛋白,研究了两种类型双水相各因素对其分配行为的影响情况,并通过分配系数和回收率对其萃取效果进行了比较。在上述试验的基础上建立了PEG/硫酸铵双水相体系的分配模型,用于预测木瓜蛋白酶的分配系数。相关性分析方法对于PPG/离子液体双水相分配模型的建立并不适用,有待进一步讨论。论文的主要工作如下：
(1)PEG/硫酸铵、PPG400/离子液体双水相相平衡的性质及其数据的测定。用浊点法测定了PEG/硫酸铵、PPG400/离子液体两种双水相的相图,考察了PEG分子量、离子液体种类、温度对相平衡的影响情况,用经验方程、Othmer-Tobias和Bancrof经验方程分别对双节线数据、相平衡数据进行了关联。研究结果显示,聚乙二醇和离子液体的成相能力顺序分别为：PEG6000PEG4000PEG2000；[Amim]Cl[C4mim]Ac[C4mim]C。 PEG硫酸铵双水相体系两相区随着温度的升高成相能力增强,即双节线更靠近原点。实验数据拟合的相关系数都0.99,说明方程关联效果很好,为下面的试验提供了理论基础。
(2)采用PEG/硫酸铵双水相体系分离纯化木瓜蛋白酶。考察成相剂种类和浓度、系统pH和酶添加量对木瓜蛋白酶分配行为的影响,同时采用响应面法优化分离条件。研究结果显示,最佳萃取条件为20.16%(w/w)PEG%(w/w)(NH4)2SO4, pH7.34,酶添加量为2mg/g。该条件下,木瓜蛋白酶的分配系数K为2.79,回收率Y为77.49%。
(3)采用PPG400/[Amim]Cl双水相体系研究木瓜蛋白酶的分配行为。研究了PPG400浓度、Amim]Cl浓度、系统pH、酶添加量和系统萃取温度对木瓜蛋白酶分配行为的影响,同时采用响应面优化了萃取条件。热力学参数显示,△rtGm00,说明木瓜蛋白酶可以自发的分配到离子液体相,分配系数K1。△trHm00,说明木瓜蛋白酶在双水相体系中的分配是一个放热过程,升高温度不利于木瓜蛋白酶萃取；最佳萃取条件为：40%(w/w)[Amim]Cl,20%(w/w)PPG400, pH7.61,酶添加量为2.24mg/g。该条件下,木瓜蛋白酶的分配系数K为3.24,回收率Y达90.78%。与PEG/硫酸铵双水相萃取木瓜蛋白酶相比,PPG400/离子液体双水相体系更适合用于木瓜蛋白酶的分离与纯化。
(4)在上述试验的基础上,通过相关系数考察PEG/硫酸铵、PPG400/[Amim]Cl双水相各组分浓度与分配系数的相关度,得到PEG/硫酸铵双水相分配系数的对数与上下相组分浓度差的相关度较高,PPG400/[Amim]Cl双水相分配系数的对数与各组分浓度相关度均小于0.7,相关度法不适用于PPG400/[Amim]Cl双水相分配模型的建立。因此,试验仅提出了木瓜蛋白酶分配系数与PEG/硫酸铵双水相成相组分浓度差的经验关系式,木瓜蛋白酶分配系数的计算值与试验值之间的相对偏差小于10%且小于其他同类模型,表明试验建立的模型对木瓜蛋白酶在聚乙二醇(、6000)/硫酸铵双水相体系中关联效果较好,可用于木瓜蛋白酶在PEG/硫酸铵双水相中分配系数的计算,为PEG/硫酸铵双水相体系中木瓜蛋白酶分配系数的工程计算和双水相萃取过程的设计提供参考。
【关键词】：
【学位授予单位】：海南大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2015【分类号】：TS201.25【目录】：
摘要4-6Abstract6-101 引言10-19 1.1 木瓜蛋白酶概述10-11
1.1.1 木瓜蛋白酶结构、性质10
1.1.2 木瓜蛋白酶分离纯化方法10-11
1.1.3 木瓜蛋白酶的应用概况11 1.2 双水相萃取技术研究进展11-15
1.2.1 双水相萃取技术概述11-12
1.2.2 双水相萃取技术的种类、特点及基本原理12-13
1.2.3 影响物质在双水相中分配的因素13
1.2.4 聚合物/盐、离子液体两种种类双水相系统在萃取分离中的应用13-15 1.3 双水相萃取分配平衡理论的研究进展15-17
1.3.1 双水相技术的基础理论15-16
1.3.2 双水相技术理论的发展16-17 1.4 本论文的研究内容及意义17-192 材料与方法19-26 2.1 主要试剂与材料19 2.2 主要仪器与设备19 2.3 木瓜蛋白酶活性的测定19-20 2.4 蛋白质含量的测定20 2.5 相平衡的试验方法20-22
2.5.1 相图的测定方法20
2.5.2 液-液相平衡数据的测定20
2.5.3 双水相系统各组分含量的测定20-22 2.6 传统双水相试验方法22-23
2.6.1 不同分子量的PEG对木瓜蛋白酶分配行为的影响22
2.6.2 PEG6000质量分数对木瓜蛋白酶分配行为的影响22
2.6.3 (NH_4)_2SO_4质量分数对分配行为的影响22
2.6.4 体系pH对木瓜蛋白酶分配行为的影响22-23
2.6.5 酶添加量对分配行为的影响23
2.6.6 响应面试验设计23 2.7 离子液体试验方法23-24
2.7.1 离子液体双水相萃取木瓜蛋白酶23-24
2.7.2 成相剂质量分数对木瓜蛋白酶分配行为的影响24
2.7.3 体系pH对分配行为的影响24
2.7.4 酶添加量对分配行为的影响24
2.7.5 温度对木瓜蛋白酶分配行为的影响24
2.7.6 响应而的试验设计24 2.8 分配模型的建立24-263 结果与分析26-57 3.1 聚乙二醇/硫酸铵双水相系统相平衡的研究26-31
3.1.1 PEG分子量对PEG/(NH_4)_2SO_4双水相体系相平衡的影响26-27
3.1.2 体系温度对PEG/(NH_4)_2SO_4双水相体系相平衡的影响27-28
3.1.3 双节线数据的关联28-29
3.1.4 利用经验方程对双水相液液相平衡数据进行关联29-31 3.2 PPG/离子液体双水相相平衡的研究31-37
3.2.1 双节线数据的测定与拟合31-34
3.2.2 PPG400/离子液体液-液相平衡数据的测定及关联34-37 3.3 PEG/硫酸铵双水相萃取木瓜蛋白酶37-44
3.3.1 不同分子量的PEG对木瓜蛋白酶分配行为的影响37-38
3.3.2 聚乙二醇6000质量分数对分配行为的影响38
3.3.3 硫酸铵质量分数对分配行为的影响38-39
3.3.4 体系pH值对分配行为的影响39-40
3.3.5 酶添加量对分配行为的影响40
3.3.6 响应面试验结果及方差分析40-44 3.4 PPG400/离子液体萃取木瓜蛋白酶44-53
3.4.1 PPG400和离子液体浓度对木瓜蛋白酶回收率的影响44-45
3.4.2 体系pH对木瓜蛋白酶分配行为的影响45-46
3.4.3 酶添加量对分配行为的影响46-47
3.4.4 温度对木瓜蛋白酶分配行为的影响47-49
3.4.5 响应面试验结果及方差分析49-53 3.5 分配系数模型53-574 讨论57-585 结论58-60 5.1 聚合物/硫酸铵、聚合物/离子液体双水相相平衡的研究58 5.2 PEG/硫酸铵双水相系统萃取木瓜蛋白酶的研究58 5.3 木瓜蛋白酶在PPG400/[Amim]Cl双水相体系的分配行为58 5.4 分配模型的建立58-60参考文献60-65附录65-67致谢67
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双水相萃取
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