如何在一个预表达蛋白序列比对前添加 6×His Tag

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如何在一个预表达蛋白序列比对前添加 6×His Tag

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2017-02-19 02:56 标签：蛋白序列比对

【求助】诱导表达蛋白western鉴定不对

現构建pet28a+目的片段原核表达载体目的片段带TAG终止密码子（重组质粒测序正确），IPTG诱导蛋白表达后理论蛋白大小约为19KD现诱导后跑SDS-PAGE在20KD大小处絀现目的蛋白！但用6*HIS tag标签抗体做western blot发现出现目的条带的确是14KD左右的蛋白！见图！这是为什么呢？将14KD蛋白切下做质谱鉴定并非所需目的蛋白！

基本可以断定20KD是目的条带14KD也许是载体上的一段产物
20KD条带用His抗体检测不到？
直接切20KD条带上质谱以质谱结果为准

因为我后面要过镍柱纯化此蛋白！所以就算蛋白鉴定是对的，它不带His tag的话该蛋白我也得不到啊！
是原使用的载体有问题吗？求助！求助！

测序验证下翻译后是否还带有his标签，一定看好阅读框包括his的阅读框。个人认为蛋白是表达出来了抗体检测不到可能是由于表达的蛋白没有his标签。his标签的阅讀框与蛋白的不一致

重组载体已经测过序，阅读框也没有问题啊！his的阅读框也是对的！为什么SDS-PAGE跑出来再14KD的地方会出现含量这么高的蛋白且空载体上也有！还带his标签？是原载体的原因

看似一切都很正确。。28a+里面有两个his难道是翻译不是从第一个m开始，是从后面某一个開始而后面那个his在同样的阅读框里面？

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