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微生物发酵法生产透明质酸(HA)
来源： 新特药房药讯
作者：百济
发布时间： 15:56:00
&&& 由山东省生物药物研究院的科研人员历时10年完成的“透明质酸（HA）及其药物制剂研发”项目成果前不久获得了2004年度国家科学技术进步二等奖。据悉，透明质酸可以被用于多种药物制剂的研究与开发。为了对HA有一个详尽的了解和认识，记者近日采访了该研究院院长凌沛学研究员。他针对透明质酸核心技术的研究及相关产品的开发等情况向记者作了介绍。&&
　　新技术提升HA产率&&
　　凌沛学告诉记者，早在上世纪80年代初，国外研究人员便从鸡冠中提取制备HA，将其作为眼科手术的黏弹剂应用于临床。20世纪80年代末，国外又相继开发出治疗骨的HA注射液。而当时国内对HA的研究尚属空白，同类药品只能依靠进口，价格十分昂贵。如何提取、工业化生产HA，并将其应用于医学临床中，成为当时国内急需解决的重大科研课题。&&
　　记者了解到，山东省生物药物研究院曾成功利用生化提取法从鸡冠中分离、提纯HA，但由于采用生化提取法工业制备HA存在原材料来源受限、成本高、工艺复杂、生产周期长、收率低（只有0.1%）等缺陷，而且这种方式生产出的HA分子量小、杂质蛋白含量高，从而阻碍了HA在医药等领域的广泛应用。能否利用新的方式工业化生产HA？经过一系列的前期研究和准备工作，该研究院的科研人员开始投入到国家科技攻关计划“微生物发酵法生产HA研究课题”中。&&
　　他们通过对菌种进行筛选、诱变，对发酵原料、发酵条件、灭菌工艺不断进行改进和优化，获得了高产率和高分子量的菌株，使HA发酵产率取得突破性提高：从3.0克/升提高至7.0克/升；随后，又利用新的代谢调控手段，分析了HA在菌体内的生物合成路线，并通过调控菌种生长速率与HA合成速率的比例，从分子水平研究多种生长因子对HA生物合成的影响，然后采用添加特种生长因子的方法，进一步优化发酵培养液配方，最终使HA的发酵产率又获得较大提高，达到10.0克/升。同时，微生物发酵生产的HA各项指标均达到甚至超过《欧洲药典》的相关要求。&&
　　用于眼部给药系统&&
　　据凌沛学介绍，眼部给药一向受眼部生理特性的制约。为了提高生物利用度，通常采用大分子物质增加药液黏度以提高药效，但效果不甚理想。而眼膏、眼膜又会导致“糊视”和异物感，患者不易接受。由于HA的非牛顿流体特性和很好的生物相容性，其网状结构可镶嵌药物、与受体结合后可长时间黏附在角膜表面，因此，HA可发挥连接药物和眼表层黏膜的桥梁作用。&&
　　为了将HA开发成为眼部给药的传递系统，凌沛学和同事们一起经反复试验，最终在国内外独创开发出以HA为媒介的眼部给药传递系统，从根本上解决了眼科制剂生物利用度低、疗效差、毒性高及刺激性大的问题，且减少了药物通过鼻泪管在鼻黏膜的吸收，为眼科疾病患者提供了一种介于眼膏和滴眼液之间的新剂型。目前，利用这项新的技术成果开发出含HA的滴眼液已多达28个品种，有的还被评为国家重点新产品。其中仅一个单项品种的年销售额便超过2亿元，创下国内单项眼科药品销售额的记录。&&
　　新型骨关节腔内注射液&&
　　骨关节炎是临床上的常见病，在中、老年人群中有很高的发病率，没有很好的治疗方法，临床上采用对症治疗的方法缓解症状，但不能从根本上解决问题。&&
　　为了进一步拓展透明质酸在骨关节炎治疗领域的应用，该研究院的科研人员采用HA作为黏弹剂，通过补充疗法从根本上对关节炎治疗模式进行了改进，进而在国内独家开发出了新药“骨关节腔注射用HA注射液”。&&
　　骨关节腔内注射用制剂的成功研制打破了临床上对该病只能对症治疗且毒副作用较大的状况，为临床提供了一个疗效确切、安全性好的药物，该类药物现已成为治疗关节炎的一线药物。&&
　在HA注射液的生产技术研发中，攻关课题组还成功地解决了HA不能高湿灭菌、因黏稠不能除菌过滤的难题，保证了产品无菌和内毒素符合要求。为了方便临床应用，他们又通过引进黏稠液体灌装机，将产品制成全无菌灌装、一次性使用的预灌装注射液，同时也解决了药液黏稠、易产生气泡的问题。&&
　　开创多项药物新剂型&&
　　凌沛学研究员告诉记者，为了充分利用透明质酸的空间阻隔和润滑作用，及其良好的抗炎、抑制出血和渗出作用，研究人员经过多次反复的试验研究，完成了预防和减少术后组织粘连的HA凝胶和粉剂的研制。这一科研成果成功地解决了外科临床棘手的术后粘连及并发症难题。&&
　　同时，他们还利用HA吸收渗液、抗炎和促进伤口愈合的功效，开发出用于烧伤治疗的新型制剂--海普林软膏。鉴于HA的润滑和保水性，在对皮肤消毒和治疗时，HA可减少皮肤所受的刺激，保护和滋润皮肤，尤其适用于对黏膜和婴幼儿皮肤消毒的诸多功效，他们又在国内首次将HA用于皮肤外用消毒品中，开发出了含HA的系列皮肤消毒产品。&&
　　凌沛学研究员最后强调，他们在研发上始终坚持“选择研究课题以市场为导向，课题工艺设计与产业化生产紧密结合”的方针，为了使科研成果高效产业化，该研究院开发的各种新产品都通过其下属的山东正大福瑞达制药有限公司投放市场，该公司也由此成为国家食品药品监督管理局批准的国内惟一拥有HA独立知识产权的生产企业。&&
　　相关链接&&
　　透明质酸（HA）又名玻璃酸钠，是一种酸性黏多糖，广泛存在于生物体内，具有优异的黏弹性、润滑性、保水性和生物相容性。&&
　　人体皮肤的细嫩、光滑和弹性主要依靠透明质酸的保水功能。鸡冠、人脐带、动物眼球的透明质酸含量丰富，是生产透明质酸的主要原料。研究发现，某些种属的链球菌在繁殖中可分泌透明质酸，由此诞生了发酵法生产透明质酸的新技术。&&
　　为克服天然透明质酸在人体易于降解的缺陷，研究人员对其进行了交联修饰。改构后的透明质酸可根据需要设计存留时间，还可以利用透明质酸的受体选择，使治疗药物定位释放，并由此产生了透明质酸给药体系的概念。
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微生物发酵法生产透明质酸的研究
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专利名称一种微生物发酵法生产透明质酸的方法
技术领域本发明属于微生物发酵领域，尤其是一种微生物发酵法生产透明质酸的方法。
背景技术透明质酸分子具有良好的保湿性和黏弹性 ，因而广泛应用于各种化妆品、保健品 眼科手术、关节注射、促进创伤愈合、调节血管壁的通透性、医用整形材料和保健品等方面， 本世纪90年代中期以来，国际市场透明质酸销量逐渐上升，目前全球药用透明质酸总销售 额为4. 2-5. 5亿美元，到2010年肯定会超过10亿美元。目前国内研究水平低下，生产能力 仅为10吨，远远不能满足市场的需求。目前国内大部分微生物发酵法生产透明质酸的企业采用的工艺发酵周期长，一般 在36-40左右，产物分子量低，产品透光率差(一般在90%左右)，蛋白质含量高，其成品葡 萄糖醛酸含量一般为35-38%，部分厂家透明质酸产品形态为纤维状，此种透明质酸溶解困 难，一般要2天左右，且收率低于75%，为了满足国内不断扩大的需求市场，透明质酸的生 产工艺亟待改善。
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种发酵周期短、产品溶解性高、成 本低的微生物发酵法生产透明质酸的方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其步骤包括(1)摇瓶种子液、(2)种子罐 种子液、(3)发酵培养得到发酵液，还包括以下步骤(4)发酵液的萃取提纯将发酵液经板框过滤后得滤液，加入2-4倍的乙醇溶液 沉淀，收集沉淀物，加入与滤液等体积的Nacl溶液搅拌溶解，进行二次板框过滤至澄清，得 到二次澄清液，将二次澄清液经0. 3-0. 5微米的滤膜或滤板过滤后，加入乙酸调节pH至 4. 0-5. 0，得到酸处理后的三次澄清液，再用乙醇溶液喷淋三次澄清液，再进行沉淀，得到沉 淀物；(5)干燥制粉将上述步骤得到的全部沉淀物经无水乙醇脱水后，用乳化泵进行 乳化制粉，得粉状沉淀，进一步用无水乙醇脱水后，50-60°C真空干燥后，含水控制在10%以 下，即得透明质酸。而且，所述板框过滤使用的硅藻土的型号为821号和616号。而且，所述821号和616号硅藻土的重量比例为1
1_5。而且，所述乙醇溶液的浓度为95% (ν/ν) 0而且，所述Nacl溶液的浓度为0. lmol/L。本发明的优点和积极效果是1、本发明采用复合诱变技术筛选出荚膜大，透明质酸产率高，不产透明质酸酶的 菌种的生产菌种，该菌种对发酵原料适应性强，透明质酸产品产率高，可达到6-7g/L，其回收率高达92%，其发酵时间仅为24-26小时，有效节省能耗。2、本发明采用独创的喷淋制粉技术，使产品结构形态更加细腻，使用性能更加优 越，溶解性更好，其透光率达到99 %。3、本发明产品的提纯过程采用板框过滤和微孔滤板过滤技术，替代活性炭吸附和 CPC吸附等复杂过程，使生产操作更加简便。4、本发明采用酸化乙醇喷淋制粉技术，制成的产品为粉末状，比絮状易于溶解。5、本发明能够将透明质酸开发成食品级、化妆品级以及医用级产品。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。本发明使用的发酵菌种属于外来菌种，菌种分类是兽疫链球菌。一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其工艺过程如下(1)摇瓶种子液将斜面菌种接种于装有灭菌培养液400ml的IL锥形瓶中，37°C 培养12-16小时，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中；(2)种子罐种子液按摇瓶种子液的配方配制培养液60L，加入种子罐中，通蒸汽 加热，121°C灭菌30分钟，冷却至37°C，用火焰法接种，将摇瓶种子液接种于种子罐中，通气 量60L/min，搅拌转速120-140/min，37°C培养12-16小时，光镜观察菌体生长良好，无杂菌 污染，即可接种于发酵罐中；(3)发酵培养按种子罐的配方，把糖的用量提高到6%，配制培养液600L，加入1 吨的发酵罐中，通蒸汽加热，121°C灭菌30分钟，冷却至37°C，将种子液通过移种管道接种 于发酵罐中，维持通气量400-600L/min，搅拌转速140-160/min，37°C培养24-26小时，发酵 过程中，糖的浓度下降至0.5%以下，PH下降很慢或不再下降时，即为发酵终点，得到含有 透明质酸发酵液；(以上3个步骤在马朝梅(广西柳州化学工业集团有限公司)，发酵法生 产透明质酸工艺研究，广西工学院学报，) 8-12中有报道，属于现有技术，本发 明申请就不再更加详细描述)，本发明申请还包括(4)发酵液的萃取提纯将发酵液经板框过滤后得滤液，加入3倍的95%乙醇沉 淀，收集沉淀物，加入与滤液等体积的0. lmol/L的Nacl溶液搅拌溶解，进行二次板框过滤 至澄清，得到二次澄清液；将二次澄清液经0. 45微米的滤膜或滤板过滤后，加入乙酸调节 pH至4. 0-5. 0，得到酸处理后的三次澄清液，再用95%乙醇喷淋三次澄清液，再进行沉淀， 得到沉淀物；板框过滤的硅藻土的型号为821号和616号，将两种硅藻土按比例混合，得到后装 入板框进行过滤，821号和616号硅藻土的重量比例为1
1-5。(5)干燥制粉将得到的全部沉淀物经无水乙醇脱水后，用乳化泵进行乳化制粉， 得粉状沉淀，进一步用无水乙醇脱水后，50-60°C真空干燥后，含水控制在10%以下，即得透 明质酸。经本发明得到的透明质酸产品产率高，可达到6_7g/L，其回收率为92%。产品性能指标性状白色粉末或细小颗粒；
气味无臭无味；pH(lg/L)
6.5-7.0;澄清度(lg/L)透光率& 99% ；干燥失重&10%;分子量&1. 8X106 ；蛋白质&0.05%; 葡萄糖醛酸彡44%;铅&20mg/石申&2mg/kg ；细菌总数&10个/克；粪大肠菌群不得检出；金黄色葡萄球菌不得检出；绿脓杆菌不得检出。
一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其步骤包括(1)摇瓶种子液、(2)种子罐种子液、(3)发酵培养得到发酵液，其特征在于还包括以下步骤(4)发酵液的萃取提纯将发酵液经板框过滤后得滤液，加入2-4倍的乙醇溶液沉淀，收集沉淀物，加入与滤液等体积的Nacl溶液搅拌溶解，进行二次板框过滤至澄清，得到二次澄清液，将二次澄清液经0.3-0.5微米的滤膜或滤板过滤后，加入乙酸调节pH至4.0-5.0，得到酸处理后的三次澄清液，再用乙醇溶液喷淋三次澄清液，再进行沉淀，得到沉淀物；(5)干燥制粉将上述步骤得到的全部沉淀物经无水乙醇脱水后，用乳化泵进行乳化制粉，得粉状沉淀，进一步用无水乙醇脱水后，50-60℃真空干燥后，含水控制在10％以下，即得透明质酸。
2.根据权利要求1所述的一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其特征在于所述 板框过滤使用的硅藻土的型号为821号和616号。
3.根据权利要求2所述的一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其特征在于所述 821号和616号硅藻土的重量比例为1
4.根据权利要求1所述的一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其特征在于所述 乙醇溶液的浓度为95% (v/v)
5.根据权利要求1所述的一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其特征在于所述 Nacl溶液的浓度为0. lmol/L。
本发明涉及一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其步骤包括(1)摇瓶种子液、(2)种子罐种子液、(3)发酵培养得到发酵液，还包括以下步骤(4)发酵液的萃取提纯将发酵液用乙醇沉淀后，再次溶解得溶解液，经二次板框过滤至澄清，再进行三次过滤得澄清液，再用乙醇喷淋澄清液，得喷淋沉淀物；(5)干燥制粉将上述步骤得到的全部沉淀物经无水乙醇脱水后，用乳化泵进行乳化制粉，得粉状沉淀，进一步用无水乙醇脱水后，50-60℃真空干燥后，即得透明质酸。本发明采用复合诱变技术筛选出荚膜大，透明质酸产率高，不产透明质酸酶的菌种的生产菌种，该菌种对发酵原料适应性强，透明质酸产品产率高，可达到6-7g/L，其回收率高达92％，其发酵时间仅为24-26小时，有效节省能耗。
文档编号C08B37/08GKSQ
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者刘小兵 申请人:天津市康婷生物工程有限公司